[发明专利]一种蚕丝蛋白质组学的蛋白质提取与富集方法

权利要求书

1.一种蚕丝蛋白质组学的蛋白质提取与富集方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取4-6mg丝素蛋白粉末于离心管中并加入1.5-2.5mL裂解液，常温反应1.5-2.5h，加入1.5-2.5mL碳酸氢铵溶液，得到蚕丝溶解液；

2）取1-1.5mL蚕丝溶解液加入至离心管中，置入恒温混匀仪中，55-65℃加热20-40分钟，转速为800-1200转/分；

3）将离心管从恒温混匀仪上取出，冷却至室温，加入80-120μL碘乙酰胺原液，将还原的二硫化物烷基化，室温暗箱孵育20-40分钟；

4）向离心管中加入40-60μL二硫苏糖醇浆液，室温下孵育10-20分钟；

5）取20-25μL步骤4）所得混合液，稀释至最终体积为90-100μL，加入180-220μg顺磁珠，混合均匀；

6）向步骤5)所得重组液中加入含80-120μL乙醇的试管中，短暂摇动进行均质，在20-25°C的恒温混匀仪中800-1200转/分孵育3-7分钟；

7）把步骤6）处理后的试管置于磁架上，进行孵育，直至磁珠迁移至管壁，除去液相后洗涤；

8）除去磁场后向步骤7）所得产物中加入80-120μL 40-60mM含0.4%SDC的碳酸氢铵溶液和3-5μL0.5μg /μL的胰蛋白酶，在35-40℃，800-1200转/分下孵育10-15h；

9）消化完成后离心处理，静置后取出上清液，得到富集和纯化的酶切液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，裂解液的配方为：含4%SDC、 pH=8.0的Tris-HCl溶液；碳酸氢铵溶液的浓度为40-60mM。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，丝素蛋白溶解液的浓度为1-1.5mg/mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，所述碘乙酰胺原液的浓度为180-220Mm。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中，二硫苏糖醇浆液的浓度为80-120mM。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5）中，稀释液用40-60mM的碳酸氢铵溶液，顺磁珠以珠状浆料方式添加。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6）中，乙醇与重组液的质量比例为1：1。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤7）中，洗涤为用60-80%的乙醇和100%乙腈交替冲洗。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤8）中，将顺磁珠完全脱离管壁分散。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤9）中，离心转速为5000-10000转/分，温度为20-30℃，时间1-5分钟。