[发明专利]一种脱细胞基质支架的制备方法及通过该方法获得的脱细胞基质支架

说明书

本发明公开了一种脱细胞基质支架的制备方法及通过该方法获得的脱细胞基质支架，制备方法包括：交联步骤：将经脱细胞处理的天然软骨基质注入模具中冷冻干燥后进行紫外交联4‑8h，然后加入EDC和NHS的混合溶液再进行交联20‑24h，清洗并冷冻干燥、灭菌，得到脱细胞基质支架；脱细胞基质支架通过上述的制备方法得到；该方法以紫外交联结合EDC和NHS的混合溶液的双交联方式，配合冻干工艺，提高了支架表面孔隙的均匀和致密性，能提升细胞在材料表面的附着、生长情况。

技术领域

本发明涉及一种脱细胞基质支架的制备方法及通过该方法获得的脱细胞基质支架，属于生物材料技术领域。

背景技术

软骨组织是由胶原组织、少许细胞、以及60-80％的水份等成份所构成，成人的软骨组织中并没有血管或神经，因此软骨组织受伤后自行修补的能力有限。

软骨组织工程的出现使人类可以通过人工手段在体内外建造出透明软骨，为关节软骨缺损的修复提供了一条颇具前途的方法。关节软骨损伤修复方式有通过一些天然材料和合成材料制备成各种支架而用于软骨组织修复中，但是天然材料的生物力学强度低，合成材料生物相容性差。进一步地，更偏向于使用异种脱细胞基质支架，其制备主要是利用化学法进行脱细胞后再成型，但该方法脱细胞效果一般、且对胶原提取程度不高、制备的支架对于软骨分化、维持其结构和透明软骨表型稳定的微环境方面仍表现欠缺。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种脱细胞基质支架的制备方法，该方法以紫外交联结合EDC和NHS的混合溶液的双交联方式，配合冻干工艺，提高了支架表面孔隙的均匀和致密性，能提升细胞在材料表面的附着、生长情况。

本发明的第二个目的在于提供通过上述制备方法所获得的脱细胞基质支架，脱细胞基质支架具有良好的空间仿生结构，能够很好地促进细胞生长。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种脱细胞基质支架的制备方法，包括：

交联步骤：将经脱细胞处理的天然软骨基质注入模具中冷冻干燥后进行紫外交联4-8h，然后加入EDC和NHS的混合溶液再进行交联20-24h，清洗并冷冻干燥、灭菌，得到脱细胞基质支架。

进一步地，交联步骤中，两次冷冻干燥的条件均为温度-60℃，时间24-48h。

进一步地，交联步骤中，EDC和NHS的混合溶液以95vt％乙醇溶液作为溶剂，EDC和NHS的浓度为2mol/L。

进一步地，交联步骤中，灭菌为以钴60进行辐照灭菌。

进一步地，交联步骤前还包括脱细胞步骤：

将天然关节软骨粉碎，加入HCl溶液并在温度为4-26℃的条件下震荡混匀后取沉淀，将沉淀清洗；在沉淀中加入蛋白酶溶液，温度为4-26℃的条件下搅拌96-120h，然后加入NaOH溶液调节至中性，离心取上清；在上清中加入NaCl溶液，进行差速离心，每一次离心后除去部分上清液，最后一次离心后除去全部上清液，取沉淀物；将沉淀物进行透析，得到经脱细胞处理的天然软骨基质。

进一步地，脱细胞步骤中，HCl溶液的浓度为2-4mol/L；震荡混匀的时间为24-48h；蛋白酶溶液的浓度为1-3g/L；NaOH溶液的浓度为1mol/L；NaCl溶液的浓度为1-4mol/L。

进一步地，脱细胞步骤中，差速离心为第一次离心的转速为2000-3000r/min，离心后除去50％上清液；第二次离心的转速为4000-5000r/min，离心后除去50％上清液；第三次离心的转速为6000-7000r/min，离心后除去50％上清液；第四次离心的转速为9000-12000r/min，离心后除去全部上清液。