[发明专利]黄牛CHRDL1基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种黄牛CHRDL1基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及其应用：以牛血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR技术，用两对引物P1、P2分别对牛CHRDL1基因CNV区域、内参基因BTF3的一段区域进行扩增，根据2*2^‑ΔΔCt确定个体CHRDL1基因的拷贝数变异类型为多拷贝型、缺失型或正常型。根据CHRDL1基因拷贝数变异与生长性状的关联分析结果，本发明可以在DNA水平上检测与牛生长性状密切相关的CNV标记，可用于牛生长性状的标记辅助选择，加速良种选育进程。

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种基于qPCR技术检测牛CHRDL1基因CNV标记的方法。

背景技术

目前肉牛分子育种研究主要集中在以分子标记为基础的标记辅助选择方面。分子育种，即分子标记辅助选择(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，从而对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(Copy Number Variations,CNVs)，属于基因组亚显微水平的结构变异，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。与单核苷酸多态性(SNP)相比，CNV区域覆盖了基因组更多的核苷酸含量，与表型变异之间的关联的机制最明显是由基因拷贝数或其相关调控元件的变异引起的基因剂量效应。

基因组未知拷贝数变异是通过基于微阵列的比较基因组杂交(CGH)的方法进行研究的，通过在一张芯片上用标记不同荧光素的样品(试验样本与对照样本)同时进行杂交，可检测试验样本基因组和对照样本基因组间DNA拷贝数的变化。CGH芯片的探针覆盖整个基因组，具有高通量及敏感度、准确度、分辨率高的特点，试验数据有较高的可信度。然而CGH芯片分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数变异片段则不易检出。同时其检测操作繁琐、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。新一代测序(NGS)技术克服了杂交技术固有的一些缺点，应用配对测序可以鉴定出复杂的结构变化，提高了检测分辨率，但成本仍较高。

对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。例如qPCR、QMPSF、MLPA、FISH、Southern blotting和MAPH。其中，实时荧光定量PCR(qPCR)最为常用。根据qPCR所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。染料法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数。例如，PCR反应体系中加入过量的SYBR Green染料分子，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量，通过对目的基因(具有拷贝数变异)及内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，并根据2^-ΔΔCt方法统计可以检测样本候选基因区域的拷贝数。

Chordin-like 1(CHRDL1)是一种分泌型糖蛋白，具有重复的富含半胱氨酸的结构域，可与BMPs家族配体结合，是在间充质组织中表达的分泌型骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂。CHRDL1增强BMP-4活性的能力可能是阐明人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化和骨重建机制的重要机制。在hBMSCs成骨过程中，BMP-4的功能被增强并依赖于CHRDL1基因在BMP-SMAD信号通路的调控作用。

目前，尚未见有关CHRDL1基因CNV对地方牛品种生长性状影响的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄牛CHRDL1基因CNV标记快速辅助检测生长性状的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：