[发明专利]一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法

说明书

本发明公开了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，步骤包括：获得灰胡杨幼叶和茎段，农杆菌侵染叶片外植体，外植体的抗性筛选，外植体的继代培养，外植体的生根培养，转基因植株的移土培养。可实现灰胡杨的转基因植株的快速培育，为灰胡杨功能基因的研究和育种奠定基础，为创制培育出镉高积累的灰胡杨新种质提供技术支撑。

技术领域

本发明属于生物技术和现代农业技术领域，具体地说，涉及一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法。

背景技术

灰胡杨具有造林和育苗成活率高、生长快、树干形通直圆满、抗溃疡病和抗天牛，还有较强的重金属镉离子富集能力，具有较好的经济价值和生态价值，是营造速生丰产林的首选树种。

利用组织培养技术，离体杨树幼叶能形成不定芽，经诱导生根后成长为再生植株。现有杨树组织培养和转基因体系仅适合于青杨组背景的NL895或者白杨组背景的84K，无法满足胡杨组背景的灰胡杨组培和遗传转化的要求。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，以灰胡杨幼叶和茎段作为基因受体材料，通过农杆菌介导的遗传转化再生体系具有方法简单，可靠性高，易操作的特点，将为现代生物技术应用于灰胡杨品种改良开辟新的途径。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，包括以下步骤：

步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸；

步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养48～60h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；

步骤3、外植体的抗性筛选：将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；

步骤4、外植体的继代培养：将外植体愈伤组织分化出的芽转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；

步骤5、外植体的生根培养

当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；

步骤6、转基因植株的移土培养：

转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后将幼苗移植到普通培养基质中生长。

可选地，灰胡杨无菌苗培养基为：WPM+BA0.1-0.3mg/L+NAA0.05-0.15mg/L+TDZ0.01-0.05mg/L+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH5.8。