[发明专利]一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法

权利要求书

1.一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸；

步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养48～60h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；

步骤3、外植体的抗性筛选：将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；

步骤4、外植体的继代培养：将外植体愈伤组织分化出的芽转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；

步骤5、外植体的生根培养

当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；

步骤6、转基因植株的移土培养：

转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后将幼苗移植到普通培养基质中生长。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，灰胡杨无菌苗培养基为：WPM+BA0.1-0.3mg/L+NAA0.05-0.15mg/L+TDZ0.01-0.05mg/L+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH5.8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗的培养温度23-28℃，每天光照14-18小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的灰胡杨叶片和茎段选择灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为25-35毫米、茎段长度为30-40毫米。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃，加Hyg至终浓度2.5mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中的所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加潮霉素至终浓度6mg/L，加入头孢霉素至终浓度300mg/L。