[发明专利]一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法

说明书

本发明创造提供了应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法，方法中应用鸡法氏囊原代细胞作为体外培养体系，将鸡法氏囊组织按照组织细胞原代培养方法制备培养成原代细胞，向鸡法氏囊原代细胞接种预先制备的禽脑脊髓炎病毒种毒进行培养，接入后收获时经冻融即得禽脑脊髓炎病毒，制得的禽脑脊髓炎病毒的滴度达到10⁶_.^5～7_.⁰EID₅₀/0.2mL。本发明创造所述的培养方法培养周期短，成本低，质量可控；培养后病毒滴度高。

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，尤其是涉及一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法。

背景技术

禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由小RNA病毒科肠道病毒属的禽脑脊髓炎病毒引起的。该病主要危害4周龄以下雏鸡，引起雏鸡共济失调，头颈部快速振颤，产蛋鸡产蛋一过性下降且孵育后代发病等，给养禽业造成严重经济损失。

禽脑脊髓炎病毒目前多采用卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚进行增殖，该方法可保证病毒滴度，但培养时间长，收获工艺繁琐，鸡胚质量不易控制，成本高等缺点给规模生产带来不便。部分文献报道该病毒可在鸡胚成纤维细胞，鸡肾细胞，鸡胚脑神经细胞上生长，但生长过程中不产生细胞病变且增殖后病毒滴度低，亦不利于规模化培养。因此，选取适于禽脑脊髓炎病毒增殖的细胞，不仅可提高病毒滴度且生产过程易于控制，培养时间短，成本低，有利于禽脑脊髓炎病毒的规模培养。

发明内容

有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种培养禽脑脊髓炎病毒的方法，所述方法中应用鸡法氏囊原代细胞作为体外培养体系，将鸡法氏囊组织按照组织细胞原代培养方法制备培养成原代细胞，向鸡法氏囊原代细胞接种预先制备的禽脑脊髓炎病毒种毒进行培养，接入后收获时经冻融即得禽脑脊髓炎病毒，制得的禽脑脊髓炎病毒的滴度达到10^6.5～7.0EID₅₀/0.2mL。

优选的，培养禽脑脊髓炎病毒过程中的细胞培养浓度为1×10⁶/mL～6×10⁶/mL，细胞维持液血清浓度为1％～3％。

更优选的，培养禽脑脊髓炎病毒过程中的细胞培养浓度为2×10⁶/mL～4×10⁶/mL，细胞维持液血清浓度为2％～3％。

优选的，所述禽脑脊髓炎病毒种毒的接种量为3％～9％。

更优选的，所述禽脑脊髓炎病毒种毒的接种量为5％～7％。

优选的，病毒收获时间为接种后1d～9d。

更优选的，病毒收获时间为接种后3d～7d。

优选的，所述鸡法氏囊原代细胞的制备方法包括如下步骤：

无菌采集7～14日龄SPF鸡法氏囊6个，加入适量PBS(pH＝7.0)，用无菌剪子将法氏囊剪碎，然后3000rpm，离心5min，弃去PBS，加入适量0.25％胰酶，37℃消化5～10min，将消化下来的细胞悬液用8层纱布过滤至装有6％新生牛血清的DMED/F12培养基中终止消化，将细胞轻轻吹打混匀，计数后接种于5％多聚赖氨酸预处理的细胞瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

优选的，上述培养禽脑脊髓炎病毒的方法中禽脑脊髓炎病毒种毒的制备方法包括如下步骤：