[发明专利]一种应用鸡法氏囊原代细胞培养禽脑脊髓炎病毒的方法

权利要求书

1.一种培养禽脑脊髓炎病毒的方法，其特征在于：所述方法中应用鸡法氏囊原代细胞作为体外培养体系，将鸡法氏囊组织按照组织细胞原代培养方法制备培养成原代细胞，向鸡法氏囊原代细胞接种预先制备的禽脑脊髓炎病毒种毒进行培养，接入后收获时经冻融即得禽脑脊髓炎病毒，制得的禽脑脊髓炎病毒的滴度达到10^6.5~7.0EID₅₀/0.2mL；

培养禽脑脊髓炎病毒过程中的细胞培养浓度为2×10⁶/mL~4×10⁶/mL，细胞维持液血清浓度为2％~3％；

所述禽脑脊髓炎病毒种毒的接种量为5％~7％；

病毒收获时间为接种后3d~7d；

所述禽脑脊髓炎病毒种毒的制备方法包括如下步骤：

将禽脑脊髓炎病毒VR株用pH=7.0的PBS溶解，然后脑内接种1日龄雏鸡，0.1mL/只，接种后观察21d，将出现共济失调，头颈部震颤的鸡只处死，无菌收集发病鸡脑，称重并加入适量pH=7.0的PBS制成20％的脑组织悬液，冻融3次后，4000rpm离心30min，吸取上清，卵黄囊接种6日龄鸡胚，0.2mL/枚，37℃孵育至16日龄，无菌收取胚体，称重，加入适量pH=7.0的PBS制成10％的组织悬液，-20℃保存备用，保存期为6个月，即为禽脑脊髓炎病毒种毒。

2.根据权利要求1所述的培养禽脑脊髓炎病毒的方法，其特征在于：所述鸡法氏囊原代细胞的制备方法包括如下步骤：

无菌采集7~14日龄SPF鸡法氏囊6个，加入适量pH=7.0的PBS，用无菌剪子将法氏囊剪碎，然后3000rpm，离心5min，弃去PBS，加入适量0.25％胰酶，37℃消化5~10min，将消化下来的细胞悬液用8层纱布过滤至装有6％新生牛血清的DMED/F12培养基中终止消化，将细胞轻轻吹打混匀，计数后接种于5％多聚赖氨酸预处理的细胞瓶中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。