[发明专利]一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：制备外泌体载体，制备靶向软骨的外泌体，制备靶向软骨的外泌体包裹miRNA‑140；本发明的有益效果为：本发明实现了miRNA药物的治疗潜力，高效、组织特异性的递送药物用于治疗骨性关节炎，主要是利用靶向外泌体包裹miRNA‑140在治疗骨关节炎药物中的应用，在大鼠的骨关节炎动物模型中，给予膝关节腔注射miRNA‑140能抑制MMP‑13表达，能显著改善其软骨基质破坏，延缓骨关节炎动物模型的软骨损伤过程，起到软骨保护的作用，因此，本发明通过外泌体靶向运输miRNA‑140，能够减缓软骨组织的降解，起到抑制软骨基质分解代谢的作用，从而控制关节软骨破坏并促进软骨修复。

技术领域

本发明涉及软骨细胞外泌体制备技术领域，具体为一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法及其应用。

背景技术

向各种特定类型的细胞靶向递送药物分子是精准医学中的主要面临的主要挑战，天然外泌体具备生物功能化纳米囊泡，该囊泡可通过基因工程的手段展示多种靶向蛋白或者多肽的配体并直接包装药物以行使药物靶向递送能力；

现有技术中，靶向软骨细胞外泌体对软骨基质破坏的改善效果不佳，且对骨关节软骨损伤过程的延缓效果不佳，造成软骨基质分解代谢较快，不利于控制关节软骨破坏。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1，制备外泌体载体，首先构建软骨细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，然后提取软骨亲和靶向外泌体；

S2，制备靶向软骨的外泌体，将步骤一中的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系，在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，离心去除死细胞及细胞碎片；

S3，制备靶向软骨的外泌体包裹miRNA-140，通过电穿孔仪把miRNA-140电转到步骤二中所获得靶向外泌体中，使外泌体包裹上miRNA，运载miRNA-140。

优选的，步骤一中，靶向外泌体的制备方法包括如下具体步骤：

a.设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR纯化；

b.将步骤a中的PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag上，构建成pCMV-lamp2b质粒

c.再将的SEQ IDNO.2所述的核酸DNA序列插入到步骤b所构建的质粒pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b。

优选的，步骤二中，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，具体步骤为：

a.提取上清液，10000g，4度离心30分钟，0.22微米膜过滤后；

b.提取上清液，10000g，4度，离心70分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；

c.提取上清液，10000g，4度，70分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体。

一种靶向软骨细胞外泌体的应用方法，其应用方法包含以下步骤：a.选取SPF级雄性8周雄性大鼠在异氟醚麻醉下，对实验大鼠左右后足进行前交叉韧带横断术；

b.通过OA关节镜下及组织切片的可以检测病理改变包括股骨髁及髌骨应力区软骨剥脱、软骨下骨裸露、软骨纤维化和半月板磨损；