[发明专利]一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备外泌体载体，首先构建软骨细胞靶向肽修饰的lamp2b重组质粒，然后提取软骨亲和靶向外泌体；

S2，制备靶向软骨的外泌体，将步骤一中的靶向肽基因改造的CAP-lamp2b重组质粒转染小鼠树枝状细胞，转染48小时后，加入G418抗生素筛选稳定表达CAP-lamp2b细胞系，在无外泌体增养基和条件下培养CAP-lamp2b细胞的细胞，收集培养基，离心去除死细胞及细胞碎片；

S3，制备靶向软骨的外泌体包裹miRNA-140，通过电穿孔仪把miRNA-140电转到步骤二中所获得靶向外泌体中，使外泌体包裹上miRNA，运载miRNA-140。

2.根据权利要求1所述的一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤一中，靶向外泌体的制备方法包括如下具体步骤：

a.设计lamp2b的引物，以小鼠cDNA为模板，PCR扩增获得lamp2b片段，PCR纯化；

b.将步骤a中的PCR纯化回收后的lamp2b基因克隆到表达载体pCMV-Tag上，构建成pCMV-lamp2b质粒

c.再将的SEQ ID NO.2所述的核酸DNA序列插入到步骤b所构建的质粒pCMV-lamp2b上，得到靶向肽基因改造的lamp2b重组质粒CAP-lamp2b。

3.根据权利要求1所述的一种靶向软骨细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤二中，通过高速离心法(差速离心)分离到大小相近的外泌体的囊泡颗粒，具体步骤为：

a.提取上清液，10000g，4度离心30分钟，0.22微米膜过滤后；

b.提取上清液，10000g，4度，离心70分钟，上清液弃去，加入36毫升PBS，混匀；

c.提取上清液，10000g，4度，70分钟，弃上清，用400ul左右PBS重悬获得外泌体。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种靶向软骨细胞外泌体的应用方法，其特征在于：其应用方法包含以下步骤：

a.选取SPF级雄性8周雄性大鼠在异氟醚麻醉下，对实验大鼠左右后足进行前交叉韧带横断术；

b.通过OA关节镜下及组织切片的可以检测病理改变包括股骨髁及髌骨应力区软骨剥脱、软骨下骨裸露、软骨纤维化和半月板磨损；

c.在建立模型后进一步通过miRNA-140的靶向外泌体进行治疗，miRNA-140的靶向外泌体进行关节腔注射，每次注射100ul体积，每隔一周注射一次，总共三周时间后进行评估实验效果，对照组用pbs替代。

5.根据权利要求4所述的一种靶向软骨细胞外泌体的应用方法，其特征在于：步骤a中，在小动物跑步机上进行高强度的跑步运动，增加后腿负荷，使关节强烈受力，达到模拟膝关节软骨长期劳损，以此建立膝骨关节炎动物模型。