[发明专利]一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法

说明书

本发明生物酶合成技术领域，特别是涉及一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L‑苹果酸的方法。本发明要解决的技术问题是富马酸酶提取的产率低、成本高。本发明的技术方案是一种利用重组大肠杆菌合成L‑苹果酸的方法，具体如下：构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌，液体培养工程菌，加入反应底物富马酸钠，全细胞催化直至反应完全，收集反应液。本申请利用分子生物学技术，通过重组大肠杆菌全细胞，以富马酸钠为转化底物生产L‑苹果酸。本发明方法中L‑苹果酸的产率可达到95％。本发明为提高苹果酸产量的研究提供方向，同时也为其他有机酸的研究奠定基础。

技术领域

本发明生物酶合成技术领域，特别是涉及一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法。

背景技术

苹果酸别名2-羟基丁二酸，是一种十分常见却又十分重要的天然有机酸，其电离常数K1为4.0×10^-4、K2为9×10^-6，是生物体内三羧酸循环成员之一。分子内含有一个不对称碳原子，有两个对映体，即L-苹果酸和D-苹果酸，分别呈左旋和右旋。在许多领域都有着广泛的用途，生产苹果酸的方法有许多，诸如化学合成法、生物合成法、直接发酵法(又称一步发酵法)、两步发酵法、酶转化法、直接抽提法等。其中的化学合成法因为合成的是消旋苹果酸，其产物很难实现良好的分离效果，在日后的研究中已经被淘汰不用。生物合成法主要采用联L-苹果酸和乳酸及固定化细胞联产L-苹果酸生产工艺。再有一步发酵法生产L-苹果酸由于需要消耗比较大的能源物质，也很少有人继续采用此方法。之后又有部分国内外人士提出使用固定化细胞和固定化酶法生产L-苹果酸，并在之后形成了一定规模的工业化生产，但是人们仍然发现这种方法的产量过低，并且成本偏高。现如今，随着科学技术的日渐发展，越来越多的人发现了生物酶这一物质的奇特之处，众所周知，酶具有专一性强，高效的催化效率，以及酶促反应的催化环境相对较为温和等特点，有着很好的工业化应用前景，酶转化法省去一系列为保证对映选择性或区域选择性而使用的繁杂操作步骤，而且由于酶促反应环境的温和性，解决了以往各种生产方法的条件苛刻性这一问题，国内孟津等改进传统酶转化法工艺与国外Efrem等对传统装置进行改进，使回收率大大提高。且有利于保护环境，节能减排。

目前工业上生物酶法制备L-苹果酸的关键酶是富马酸酶。富马酸酶，又名延胡索酸酶，作用是催化延胡索酸和苹果酸之间的相互转化。由于富马酸酶在生产苹果酸上起着关键的作用。富马酸酶在自然界中广泛存在于产氨短杆菌、脱氮副球菌、黄色短杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及短乳杆菌等微生物中。虽然富马酸酶存在广泛，但是在生物合成富马酸酶的过程中，仍然遇到存在产率低，成本高的问题，这仍然将成为日后研究苹果酸转化的重点方向。

发明内容

本发明要解决的技术问题是富马酸酶提取的产率低、成本高。

本发明的技术方案是一种利用重组大肠杆菌全细胞催化合成L-苹果酸的方法，具体如下：构建表达富马酸酶基因的大肠杆菌工程菌，液体培养工程菌，离心收集湿菌体细胞，，加入反应底物富马酸钠，全细胞催化至反应完全，收集反应液。

具体的，所述反应温度为30～40℃。

优选的，所述反应温度为35℃。

具体的，所述反应pH为7～8。

优选的，所述反应pH为7。

进一步的，所述反应时间为8～12h。

优选的，所述反应时间为10h。

具体的，所述反应体系中，每10mL转化合成体系中添加0.5～2g富马酸钠和0.05～2g湿菌体细胞。

具体的，所述反应体系中，每10mL转化合成体系中添加1g富马酸钠和0.1g湿菌体细胞。

进一步的，所述的反应体系中还添加有终浓度为50mmoL.L^-1的Ca²⁺或/和终体积分数为0.03％～0.06％的烷基酚聚氧乙烯醚OP。