[发明专利]一种生物体或组织中dsRNA及提取该dsRNA的方法

说明书

本发明涉及一种生物体或组织中dsRNA及提取该dsRNA的方法。该方法包括预处理、离心获取上清液的步骤，将上清液进行层析并分段洗脱的步骤，以及收集洗脱液进行后处理的步骤。本发明结合有机试剂处理和纤维素柱层析，先对生物体或组织进行处理，促使其破碎，以释放核酸物质至液相中；再利有纤维素柱层析中填料对液相中浓度核酸物质进行可逆性吸附，通过分段洗脱，能够有效分离dsRNA与其他核酸物质，尤其能够显著降低DNA降解物质的干扰，提高最终产品dsRNA的纯度。

技术领域

本发明涉及dsRNA提取技术领域，尤其涉及一种生物体或组织中dsRNA及提取该dsRNA的方法。

背景技术

在正常的动植物体内很难检测到双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的大量存在，任何导致正常植物体dsRNA形成的情况都会引起相应基因的沉寂，这是寄主的的dsRNA切割酶(Dicer酶)切割的结果，所以正常动植物体内各种基因的有效表达需要一套严密防止dsRNA形成的机制，这就是生物体内的RNA干涉(RNA interference,RNAi)。利用RNAi原理和技术，借助转基因或纳米载体或其它手段，能够特异性降低或关闭寄主或病原物基因表达。这种技术已经在基因组学研究、转基因动植物培育、有害生物防治、基因治疗和药物研发等领域取得了一定的成果。如2006年在猪IBRS-2细胞水平上，利用人重组腺病毒表达的口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)特异的siRNA能有效抑制FMDV的复制；近些年，在饲喂干扰昆虫特异的V-ATPase基因的dsRNA溶液，或饲喂表达dsRNA的植物，或病毒介导V-ATPase的基因敲除，实现西方玉米根叶甲、柑橘粉蚧、豌豆蚜、棉蚜、烟粉虱、赤拟谷盗、烟草天蛾等害虫的死亡或有效控制；抗植物病毒方面，人们将外源病毒的基因片段导入靶标植物基因组，表达形成dsRNA后，使得入侵的病毒以及同属病毒中序列相近的RNA降解，病毒体内复制增殖过程被阻断，转基因植物因此获得抗性,成功的案例很多，如水稻抗RDV、烟草抗TMV、番木瓜抗PRSV等。但是转基因作物不容易被大多数国家和民众接收。因此，科学家尝试多种体外表达病毒的dsRNAs，通过不同方法被寄主或介体吸收，从而达到干扰病毒侵染的目的。2001年Timmons发现一种缺乏dsRNA特定的核酸内切酶RNaseIII的大肠杆菌原核表达菌株(HT115)，该菌株能诱导表达目的基因特异的dsRNAs。将细菌原核表达的PMMoV病毒特异dsRNA喷到植物叶片上，几天后在喷洒dsRNAs的同一叶片上接种PMMoV，观察发现PMMoV不能侵染该植物。2016年Naga等应用T7 RNA聚合酶(T7 RiboMAXExpress RNAi System)合成TMV p126 and CP基因的dsRNAs，通过注射方法浸润烟草叶片，接种植株成功抵御TMV的侵染。在RNAi技术应用过程中，如果是体外施放dsRNA，其制备非常重要，其中dsRNA的大量提取尤为关键。

另外，动植物体遭受到RNA病毒入侵后，往往能够产生dsRNA，有些dsRNA是病毒的基因组，有些dsRNA是病毒侵染过程中产生的复制中间体。如当前国内流行的水稻病毒病RDV(Rice dwarf virus)、RRSV(Rice ragged stunt birus)等，它们都有特异的dsRNA基因组图谱。通过提取患病组织中的dsRNA，可以用于鉴定动植物病毒的种类以及进一步分析其核酸遗传和变异的基础。因此，从患病动植物体内提取dsRNA是RNA病毒研究中的基础操作技术。

目前的dsRNA提取方法有：(1)TRIzol法，即先提取获得总RNA后用DNA酶和RNA酶消化处理，以此得到dsRNA，但该种方法提取得到的dsRNA质量较差，效率很低。(2)LiCl沉淀法，即先提取获得总RNA后用LiCl进行密度梯度离心，以此得到dsRNA，但该种方法提取得到的dsRNA质量也比较差，并且更重要的是操作繁琐并且试剂的价格过于昂贵。