[发明专利]一种全细胞催化L-精氨酸合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种全细胞催化L‑精氨酸合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法，属于生物工程领域。本发明在大肠杆菌中表达了精氨酸羟化酶、精氨酸酶以及鸟氨酸环化脱氨酶，能够以L‑精氨酸为底物生产trans‑4‑Hyp的重组大肠杆菌，为微生物发酵生产Hyp提供了新的途径及生产思路。本发明提供的这种微生物全细胞生产Hyp的方法，具有反应条件温和、原工艺简单、易于控制等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种全细胞催化L-精氨酸合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-Hyp)是重要的一种氨基酸，是胶原蛋白的主要成分。它通过允许胶原蛋白螺旋与脯氨酸的急剧扭曲而起到胶原稳定性的关键作用。Hyp可以通过几种脯氨酰羟化酶使氨基酸脯氨酸羟基化产生，从而产生不同的羟脯氨酸。其中最重要的是Hyp，它也是胶原蛋白中最丰富的成分。Hyp已广泛应用于生物化学，食品，化妆品等领域。在微生物中Hyp也涉及在放线菌素，棘白菌素，宜他霉素和纽莫康定等次级代谢物质合成。此外，Hyp的衍生物之一N-乙酰基反式-4-羟基脯氨酸，作为促进骨关节炎治疗的炎症抑制剂。

利用微生物法生产Hyp原对环境污染小，随着微生物资源的开发和各种合成生物学技术的迅速发展，微生物法生产trans-4-Hyp具有良好的应用前景。但是目前的微生物法生产trans-4-Hyp的方法还较少，催化生产的过程大多繁琐、消耗大量资源。

发明内容

本发明鉴于现有技术中存在的微生物转化生产trans-4-Hyp的方法较少、催化过程繁琐等问题，在传统的生产trans-4-Hyp的方法的基础上，改变了之前的由脯氨酸羟化酶对L-脯氨酸进行羟化，本发明利用“提前羟化”策略，以L-精氨酸为前体，先将其羟化为4-羟基-L-精氨酸，后在精氨酸酶及鸟氨酸环化脱氨酶的级联催化下生成trans-4-Hyp，为微生物发酵生产Hyp提供了新的途径及生产思路。

本发明提供了鸟氨酸环化脱氨酶突变体，所述突变体以NCBI登录号为WP_010954390所示的氨基酸为亲本，将亲本的第162位和/或第205位氨基酸位氨基酸突变。

在一种实施方式中，编码所述鸟氨酸环化脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示

在一种实施方式中，所述突变体为(a)～(c)所示任一：

(a)将亲本第162位的苏氨酸突变为丙氨酸，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；

(b)将亲本第205位的赖氨酸突变为甘氨酸，其编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

(c)将亲本第162位的苏氨酸突变为丙氨酸，同时将第205位的赖氨酸突变为甘氨酸，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

本发明提供了携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体以pET28a或pACYCDuet-1为出发载体。

本发明提供了携带所述基因的微生物细胞。

本发明提供了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，以同时表达L-精氨酸羟化酶、L-精氨酸酶及所述突变体的重组菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸。

在一种实施方式中，编码所述L-精氨酸羟化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述L-精氨酸酶来源于Bacillus amyloliquefaciens，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。