[发明专利]一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、两种或两种以上DNA糖基化酶识别序列、报告探针；所述双链DNA底物包括用于识别一种或多种DNA糖基化酶识别序列，双链DNA底物两条链的5'末端分别修饰荧光淬灭基团，所述报告探针被荧光基团修饰，所述荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对。基于荧光化学传感器的信号放大技术可实现对多种DNA糖基化酶的超灵敏检测。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，其分子结构的完整性和稳定性对于细胞的存活和正常生理活动的发挥具有重要意义。然而在日常生活中，紫外线、电离辐射、化学诱变剂、活性氧自由基等内源性及外源性理化因素的影响持续威胁着基因组DNA的稳定，产生各种各样的DNA损伤，包括碱基的缺失、插入、替换，DNA链断裂及交联等。这些损伤如果不被及时修复，很可能会干扰细胞的正常生理功能，导致细胞衰老、凋亡以及癌变等。为维持基因组DNA的稳定与完整，细胞在进化中形成了一系列损伤修复机制来识别和修复受损的DNA分子，例如碱基切除修复、核苷酸切除修复、错配修复、同源重组以及非同源末端连接等。碱基切除修复在DNA碱基发生自氧化、脱氨基、甲基化和脱嘌呤等损伤后被激活，并由DNA糖基化酶引发。DNA糖基化酶识别受损碱基，通过DNA链的局部扭曲而使受损碱基突出，之后水解受损碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键，除去受损碱基，从而产生无嘌呤/无嘧啶位点。大量研究表明，DNA糖基化酶的表达异常会引起碱基切除修复的功能障碍，最终导致各种疾病，例如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等。典型的例子包括肺癌患者外周血单核细胞中人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)过量表达，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)活性异常与人类免疫缺陷和癌症密切相关。

实现多种DNA糖基化酶的同时、超灵敏检测对于准确评估疾病发生几率，疾病早期诊断、治疗及分子机制的研究具有十分重要的意义。传统的检测方法包括凝胶电泳(gelelectrophoresis)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱/同位素稀释串联质谱(LC-MS/MS)，放射性标记(radiolabeling)，蛋白质印记(western blot)，酶联免疫吸附(ELISA)等。

发明人研究现有检测技术后发现，凝胶电泳(gel electrophoresis)灵敏度低，且无法准确定量。高效液相色谱(HPLC)和液相色谱/同位素稀释串联质谱(LC-MS/MS)仪器昂贵，且通常会由于操作过程中对碱基造成的人工损坏而导致高的背景信号。而酶联免疫吸附(ELISA)需要昂贵的特异性抗体和复杂的样品处理过程，且多步洗涤过程对样品造成的损耗会导致测定值偏低。为克服这些问题，一些新的DNA糖基化酶测定方法，例如比色法，发光法，电化学法和荧光方法被开发出来。然而，它们也都存在一些无法避免的缺点。比色法简单易行，但仅适用于成分相对简单、显色不易被干扰的体系。发光法，电化学法和荧光法分析速度快、选择性好、可用于准确定量，但灵敏度不高限制了它们在低浓度复杂样品中的应用。

发明内容