[发明专利]一种同时检测多种DNA糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用

权利要求书

1.检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括双链DNA底物、报告探针、酶、缓冲液和dNTPs；

所述双链DNA底物包括用于识别两种DNA糖基化酶识别序列，双链DNA底物两条链的5'末端分别修饰荧光淬灭基团，所述报告探针被荧光基团修饰，所述荧光淬灭基团连接的碱基序列与报告探针杂交形成碱基对；

所述双链DNA底物中，其中一条链中具有用于识别一种DNA糖基化酶识别序列，另一条链上具有识别另一种DNA糖基化酶识别序列；

所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG；

当所述DNA糖基化酶为UDG时，DNA糖基化酶识别序列为5'-BHQ1-GCT CGT CAC TGT CCTAGC AGT GAG ATA GAG CTC TGA GAA TCT ACG TAC UTC CA-NH₂-3'，U代表脱氧尿嘧啶；

当所述DNA糖基化酶为hAAG时，DNA糖基化酶识别序列为5'-BHQ2-GTG CAC TCG ATCGCA GGC AGT GAG CAA TGG AAG TAC GTA GAT TCT CAG IGC TC-NH₂-3'，I代表次黄嘌呤；

所述双链DNA底物3'末端修饰NH₂；

所述双链DNA底物5'末端分别修饰BHQ1和BHQ2淬灭基团；

所述荧光基团包括Cy3和Cy5，Cy3标记的报告探针和Cy5标记的报告探针分别与连有BHQ1和BHQ2淬灭基团的碱基序列杂交形成碱基对，BHQ1与Cy3邻近，BHQ2与Cy5邻近；

Cy3标记的报告探针的碱基序列为ACA GTG ACG AGC-Cy3；

Cy5标记的报告探针的碱基序列为GAT CGA GTG CAC-Cy5；

所述酶包括脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、Nb.BtsI切刻酶和Klenow片段DNA聚合酶。

2.根据权利要求1所述的检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器，其特征在于，所述UDG识别序列和hAAG识别序列位于双链DNA底物的不同链上。

3.权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，包括：

将一种DNA糖基化酶识别序列和另一种DNA糖基化酶识别序列，与被荧光基团修饰的报告探针在缓冲液中加热进行反应，冷却后形成同时检测两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器；

所述每种DNA糖基化酶识别序列和被荧光基团修饰的报告探针浓度为10µM/L；

所述加热温度为80-100℃，保温5-10分钟。

4.根据权利要求3所述的检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器的制备方法，其特征在于，所述加热温度为95℃，所述保温5分钟。

5.权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器在非疾病诊断目的的DNA糖基化酶检测中的应用；

所述DNA糖基化酶至少为两个；

所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG。

6.一种非疾病诊断目的的检测一种或两种DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述方法包括：

1）将待测样品和权利要求1-2任一项所述检测一种或两种DNA糖基化酶的荧光化学传感器混合反应；

2）将步骤1）产物加入脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Nb.BtsI切刻酶，进行反应。

7.如权利要求6所述非疾病诊断目的的检测一种或两种DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述检测方法还包括采用荧光检测系统测定荧光信号，从而实现对DNA糖基化酶的定量检测。