[发明专利]一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法

说明书

本发明提供一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法，所述细胞株过表达生存素Survivin蛋白，同时不表达谷氨酰胺合成酶，所述细胞株基于CRISPR/cas9基因编辑技术将外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶位点得到。本发明通过敲除谷氨酰胺合成酶(GS)并高表达生存素Survivin基因，建立了抗凋亡能力强的单克隆细胞株，该单克隆细胞株能够显著提高最终产物的效价，适用于抗体、疫苗和重组蛋白等生物制药工业中蛋白质的高效和高活性规模化生产，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法。

背景技术

随着生物科学的高速发展，生物治疗药物占整个医药市场的比例越来越大。哺乳动物细胞作为表达系统能够指导蛋白进行正确折叠、组装以及提供复杂的N型和O型糖基化等翻译后修饰，不需要对蛋白进行复性，使表达蛋白的结构、特性和功能最接近天然的蛋白质分子，因此已经成为生产生物药物的一种重要工具。

然而，在细胞培养过程中，由压力引起的细胞死亡是制约着工业生物制药生产的主要问题之一。细胞死亡不仅会降低细胞培养物中的产品产量，而且还可能对产品质量产生负面影响。尤其在细胞培养的后期，细胞死亡加剧，导致蛋白酶，糖基化酶和唾液酸酶释放的增加，可能造成目的蛋白质的降解或者改变蛋白质聚糖结构。此外，细胞死亡产生的碎片会使下游处理复杂化。上述这些问题会导致最终产物的效价大幅度降低，降幅甚至高达30％。

哺乳动物细胞死亡的主要方式有两种：凋亡和坏死，其中凋亡已被证明是哺乳动物细胞培养中的主要细胞死亡机制。凋亡是指基于细胞外和细胞内信号作出反应的程序性细胞死亡，细胞凋亡的生理学特征是细胞体积的有序损失，膜起泡，核浓缩和DNA片段化。在生物制药生产的细胞培养的背景下，这些细胞机制是不良事件，与工业生产获高效价的最终产物的目标相冲突。

因此，如何有效抑制细胞培养过程中的细胞凋亡，提高最终产物的效价已成为目前生物制药生产行业亟需解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种抗凋亡单克隆细胞株，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术定点改造宿主细胞使之提高抗凋亡能力，提高最终产物的效价。

本发明的第二个目的在于，提供上述抗凋亡单克隆细胞株的制备方法。

本发明的第三个目的在于，提供上述抗凋亡单克隆细胞株在重组蛋白表达中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供了一种抗凋亡哺乳动物细胞株，所述细胞株过表达生存素Survivin蛋白，同时不表达谷氨酰胺合成酶，所述细胞株基于CRISPR/cas9基因编辑技术将外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶位点得到；

所述外源表达盒由启动子、筛选基因、survivin基因和终止子以串联方式得到，所述survivin基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

作为一个优选方案，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子、SV40启动子、RSV启动子或PGK启动子中的一种。

作为一个优选方案，所述筛选基因为EGFP基因、Cherry基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或潮霉素抗性基因中的一种。

作为一个优选方案，所述终止子为BGH PloyA或SV40 PolyA。

作为一个优选方案，所述外源表达盒由CMV强启动子、EGFP荧光筛选基因survivin基因和BGH polyA尾巴以串联方式得到。

作为一个优选方案，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、非洲猴肾细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠骨髓瘤细胞或人胚胎肾细胞。

作为一个优选方案，所述外源表达盒的制备方法包括如下步骤：