[发明专利]一种抗凋亡单克隆细胞株及其制备方法

权利要求书

1.一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述细胞株过表达生存素Survivin蛋白，同时不表达谷氨酰胺合成酶，所述细胞株基于CRISPR/cas9基因编辑技术将外源表达盒整合到宿主细胞的谷氨酰胺合成酶位点得到；

所述外源表达盒由启动子、筛选基因、survivin基因和终止子以串联方式得到，所述survivin基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子、SV40启动子、RSV启动子或PGK启动子中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述筛选基因为EGFP基因、Cherry基因、嘌呤霉素抗性基因、新霉素抗性基因、氯霉素抗性基因或潮霉素抗性基因中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述终止子为BGHPloyA或SV40 PolyA。

5.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述外源表达盒由CMV强启动子、EGFP荧光筛选基因survivin基因和BGH polyA尾巴以串联方式得到。

6.根据权利要求1所述的一种抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、非洲猴肾细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠骨髓瘤细胞或人胚胎肾细胞。

7.如权利要求1所述的抗凋亡单克隆细胞株，其特征在于，所述外源表达盒的制备方法包括如下步骤：

获取启动子、筛选基因、生存素基因、终止子以及线性化载体；

将所述启动子、筛选基因、生存素基因、终止子以及线性化载体加入PCR管中混合均匀，并加入同源重组酶，于50℃的水浴锅中进行连接反应，待反应完成后挑选阳性单克隆细胞于含有Amp的LB培养基中培养12h，即得；

其中，在上述连接反应中所用到的引物包括：

正向引物序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示的启动子和筛选基因的连接引物组；

正向引物序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物序列如SEQ ID NO:8所示的生存素基因连接引物组；以及

正向引物序列如SEQ ID NO:9所示，反向引物序列如SEQ ID NO:10所示的终止子连接引物组。

8.如权利要求1～7任意一项所述的抗凋亡单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，包括：

构建sgRNA-Cas9基因编辑载体，所述基因编辑载体包括pX458-GS-sgRNA与pX459-GS-sgRNA；

对冻存的宿主细胞进行复苏、传代培养处理，得到待转染的宿主细胞；

采用pX458-GS-sgRNA单转染待转染的宿主细胞，并采用pX459-GS-sgRNA与外源表达盒共转染待转染的宿主细胞，并进行单克隆挑选，得到抗凋亡单克隆细胞株。

9.如权利要求8所述的抗凋亡单克隆细胞株的制备方法，其特征在于，所述对冻存的宿主细胞进行复苏、传代培养处理，得到待转染的宿主细胞的步骤，具体包括：

对冻存的宿主细胞进行解冻处理，得到宿主细胞悬液；

对宿主细胞悬液移进行离心处理去除冻存液后，用37℃预温的F-12K培养基上下缓慢吹打宿主细胞沉淀，并将宿主细胞转移至T-25的培养瓶中，再补充F-12K培养基，并于37℃、5％CO₂的培养箱中进行细胞培养；

当培养至宿主细胞密度达到80-90％时，进行传代培养，获得待转染的宿主细胞。

10.权利要求1～7任一所述抗凋亡单克隆细胞株在重组蛋白表达中的应用。