[发明专利]一种虎奶菇原生质体制备方法

说明书

本发明涉及一种虎奶菇原生质体制备方法，属于生物工程技术领域。本发明是根据虎奶菇细胞壁多糖的糖苷键构成，选取纤维素酶对其进行酶解，有效获得了虎奶菇原生质体，数量可达到5×10supgt;6/supgt;个/mL，再生率达到11％。本发明所涉及的方法，工序简便、操作性强，在食药用菌资源开发、遗传育种、分子生物学和微生物学等领域均具有潜在的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种虎奶菇原生质体制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

虎奶菇(Pleurotus tuber-regium)，学名菌核侧耳，是一类主要分布于热带及亚热带地区的珍稀食药用真菌，不仅具有极高的营养价值，还富含多种生物活性成分。关于虎奶菇的研究还主要停留在活性成分的分离纯化和开发阶段，其中活性成分的合成机制和菌核形成机制的研究还鲜有涉及。相关方面的研究，需要借助分子生物学的手段来进行深入的探究，而原生质体的获得便成为了关键的一步。目前，原生质体在灵芝、草菇、平菇等食用菌中的研究较多，而未见关于虎奶菇中原生质体制备及应用的研究。

原生质体是食用菌细胞生物学研究的重要工具，以原生质体为受体进行瞬时转化，可广泛用于目标基因蛋白的亚细胞定位、启动子及蛋白活性检测、BIFC(bimolecularfluorescence complementation双分子荧光互补)蛋白与蛋白互作等基因功能研究。而原生质体作为虎奶菇遗传转化的理想受体，高效制备虎奶菇原生质体是研究虎奶菇活性成分合成的重要基础。

发明内容

[技术问题]

现有技术中没有有效制备虎奶菇中原生质体的方法，需要开发一种安全高效地提取虎奶菇中原生质体的方法。

[技术方案]

本发明的第一个目的是提供一种制备虎奶菇原生质体的方法，针对虎奶菇细胞壁多糖的糖苷键构成，采用纤维素酶溶液处理虎奶菇菌丝体的方法，有效破除细胞壁。

在本发明的一种实施方式中，所述纤维素酶溶液含有渗透压稳定剂。

在本发明的一种实施方式中，所述渗透压稳定剂为0.6mol/L的蔗糖溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述纤维素酶溶液是指将纤维素酶用渗透压稳定剂溶解，经无菌过滤后，直接使用或-20℃冷冻保存。

在本发明的一种实施方式中，所述无菌过滤采用0.22μm无菌的微孔滤膜。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：

(1)虎奶菇菌丝体培养至对数生长期时取样，用渗透压稳定剂洗涤3～5次；

(2)洗涤后的菌体加入β-巯基乙醇预处理20min，过滤收集菌体，再以渗透压稳定剂洗涤；

(3)将虎奶菇菌丝体与纤维素酶溶液混合，28～32℃酶解1～4h，过滤收集滤液；

(4)将收集到的滤液以3500～4500g转速离心10～15min，小心去除上清液，用渗透压稳定剂将沉淀洗涤3～5次，获得虎奶菇原生质体。

在本发明的一种实施方式中，上述方法中所述的渗透压稳定剂为0.6mol/L的蔗糖溶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的虎奶菇菌丝体对数生长期为虎奶菇菌丝体接种至发酵培养液后的第3～5天。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的虎奶菇菌丝体培养至对数生长期的方法为：将虎奶菇菌种接种在PDA平板上，静置培养6～8天后，从平板上切下5～10块1cm²含有菌体的小块，加入种子培养基中，培养2～4天后获得种子液，再将种子液接种至发酵培养液中进行培养3～5天。