[发明专利]基于飞行时间质谱平台的rooptag不对称多重PCR诊断肺小结节良恶性的方法

说明书

本发明公布了核酸质谱技术诊断肺小结节良恶性的检测方法及试剂盒，具体涉及一种基于核酸质谱技术联合鉴别诊断肺小结节良恶性DNA突变和甲基化水平的方法及其应用。本发明基于rooptag引物及不对称多重PCR技术，从血液和痰液样本中检测EGFR、TP53、KRAS、SOX17、TAC1、HOX9、SHOX2及CDO1基因其中一个或多个靶标位点，作为诊断肺结节病的生物标志物分子的用途，使用这些标志物可以辅助活体组织检查，帮助确诊相关的肺部疾病，本发明收集了一定量的临床样本进行研究和验证，研究成果符合临床实际，具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及的是本发明属于飞行时间质谱基因检测技术领域，涉及一种本发明涉及分子生物学技术领域，涉及肺结节良恶性的甄别，具体用于肺部微小结节良恶性甄别的标志物及其用途。针对EGFR、TP53、KRAS、SOX17、TAC1、HOX9、SHOX2及CDO1基因其中一个或多个靶标位点，设计每个位点的rooptag引物引物组合，通过不对称多重PCR，进而进行质谱分析其特异性的产物，鉴别肺小结节良恶性类型。本发明及应用涉及的技术领域是医学检验和核酸质谱技术。

背景技术

肺癌是我国城市人口癌症死亡的首要原因，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布了2020年全球最新癌症负担数据。预估了全球185个国家36种癌症类型的最新发病率、死亡率情况，以及癌症发展趋势。这项最新预估数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，其中，肺癌高达220万例，仅次于乳腺癌。2020年全球癌症死亡病例996万例，其中肺癌死亡180万例，远超其他癌症类型，位居癌症死亡人数第一。

肺癌的预后与确诊时的临床分期密切相关，其中，对超早期的Ia期周围型原位肺癌的治疗效果最好，患者术后5年生存率高达90％，而II-IV期的病人总的5年生存率则从34％下降到5％以下。因此提高肺癌治愈率、降低死亡率的关键是早期发现。

当前采用低剂量螺旋CT(LDCT)等高分辨影像学检查方法对高危人群进行检查是肺癌早期筛查的一种主要手段，可以筛查几个毫米的肺部结节，辐射剂量低于普通CT，略高于传统X线胸片。低剂量螺旋CT筛查是收益与风险并存：首先是长期的每年CT复查不可避免地增加了辐射暴露风险；其次是高检出率意味着大量的肺小结节被发现，早期肺部结节并不全是肺癌，肺小结节肺癌恶性概率为0.5％～3.6％，发现并手术可能造成过度干预；最后CT检查也有自己的“盲区”，尤其是早期中央型肺癌、肺门增厚、肺结核疤痕等难以判断。2018年NCCN指南推荐50岁重度吸烟高危人群行肺癌CT筛查，而中低危患者不常规推荐CT筛查。基因突变和甲基化检测可作为肺癌CT筛查的补充方法之一用于鉴别肺小结节良恶性和早期肺癌。

MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlight mass spectrometry)，即基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离质谱，具有灵敏度高、检测速度快、样本用量少、高通量等特点。MALDI-TOF质谱仪检测的基本原理为分析物样本和基质形成共结晶，当用激光轰击共结晶体的时候，基质吸收能量并将其传递给分析物，辅助分析物分析解吸附并实现离子化，由固态变为气态离子。带电荷的离子，经加速电压通过飞行时间离子分离器，进而被离子检测器所检测。这个过程中，因为离子质量大小不同，飞行到达检测器时间的长短不同，最后将质量不同的离子根据质荷比分离开来，形成质谱图。

目前基于单碱基引物延伸原理的核酸质谱法得到了广泛的应用，尤其是飞行时间质谱在 SNP 分型检测市场上得到了广泛的应用，较成熟的方法包括：MassExtendassay，iPLEX assay， PinPoint assay，GOOD assay 等，他们有一个共同点，都是通过精确测量延伸产物的分子量，从而判断样品中耐药基因是否存在。