[发明专利]基于飞行时间质谱平台的rooptag不对称多重PCR诊断肺小结节良恶性的方法

权利要求书

1.本发明的核酸质谱法整合了Rooptag引物+不对称多重PCR，是一种基于核酸质谱技术联合鉴别诊断肺小结节良恶性DNA突变和甲基化水平的方法，其特征在于，通过不对称多重PCR扩增EGFR、TTP53、KRAS、PTEN、PIK3CA、SOX17、TAC1、HOX9、SHOX2及CDO1基因其中一个或多个靶标位点，作为诊断肺结节病的生物标志物分子的用途。

2.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术联合鉴别诊断肺小结节良恶性DNA突变和甲基化水平，通过不对称多重PCR扩增EGFR、TTP53、KRAS、PTEN、PIK3CA 基因中一个或者多个靶点位置中来检测与肺癌相关的突变信息。

3.根据权利要求1所述的一种基于核酸质谱技术联合鉴别诊断肺小结节良恶性DNA突变和甲基化水平，通过不对称多重PCR扩增SOX17、TAC1、HOX9、SHOX2及CDO1基因中一个或者多个靶点位置来检测肺癌相关甲基化异常信息。

4.根据权利要求3所述，甲基化异常信息的检测需要对DNA样本进行重亚硫酸盐转化。

5.根据权利要求4所述，对DNA样本进行重亚硫酸盐转化的步骤为：95℃15min→65℃150min；重亚硫酸盐的主要成分为：30-80%重量体积比的亚硫酸氢钠，20%-50%重量体积比亚硫酸钠，5-10%甘油，200-500mM 氢氧化钠。

6.根据权利要求1所述，本发明的样本为患者痰液或肺泡灌洗液，血浆、血清等样本，取样方便、无创。

7.根据权利要求1所述，肺小结节检测甲基化或者突变的引物由这些基因中肺癌相关靶点的野生型抑制性rooptag上游引物，常规野生型引物特异性引物，tag引物以及常规下游引物组合。

8.根据权利要求 8所述，野生型抑制性rooptag上游引物是由3部分序列构成5端MGB修饰，并且和变异位点区域野生型有10-15bp互补，该互补区域覆盖SNP等变异位点，3端在SNP等变异位点上游3-5bp处，与5端序列存在这2-4bp的重叠，中间为tag区域，根据不同的检测靶标可以设计不同的tag。

9.根据权利要求8所述，野生型抑制性rooptag上游引物只有在引物5端序列互补模板存在变异时，才会扩增模板，该引物只有在引物5端序列互补模板存在变异时，才会扩增模板，否则野生型抑制性rooptag上游引物不扩增。

10.根据权利要求8所述， 常规野生型引物，没有tag和roop序列只扩增野生型模板。