[发明专利]基于飞行时间质谱平台的rooptag不对称多重PCR检测心血管疾病用药基因的方法

权利要求书

1.本发明的核酸质谱法整合了Rooptag引物+不对称多重PCR，通过不对称多重PCR对病原体耐药基因进行扩增，提高检出的灵敏性；无需通过单碱基延伸反应通过对延伸引物进行一个碱基扩增，然后通过区分延伸产物分子质量进行病原体识别；同时，核酸质谱的通量高，一个反应孔最高可实现100重扩增区域均一化的扩增；具有自动化程度高、检测通量高、特异性好的优点。其特征在于：包括11种基因17个突变位点的检测试剂，所述11种基因17个突变位点为VKORC1基因c.1173CT和c.-1639GA位点，CYP2C9基因c.430CT和c.1075AC位点；CYP2D6基因c.100CT位点，ADRB1基因c.1165GC位点，ACE基因I/D位点，AGTR1基因c.1166AC位点，MTHFR基因C677T位点，SLCO1B1基因c.388AG和c.521TC位点，APOE基因c.388TC和c.526CT位点，CYP2C19基因c.681GA、c.636GA和c.-806CT位点，ALDH2基因c.1510GA位点。

2.根据权利要求 1所述，11种基因17个突变位点的检测引物由一种心血管疾病用药相关基因的基因的野生型抑制性rooptag上游引物，常规野生型引物特异性引物，tag引物以及常规下游引物组合。

3.根据权利要求 2所述，野生型抑制性rooptag上游引物是由3部分序列构成5端MGB修饰，并且和变异位点区域野生型有10-15bp互补，该互补区域覆盖SNP等变异位点，3端在SNP等变异位点上游3-5bp处，与5端序列存在这2-4bp的重叠，中间为tag区域，根据不同的检测靶标可以设计不同的tag。

4.根据权利要求3所述，野生型抑制性rooptag上游引物只有在引物5端序列互补模板存在变异时，才会扩增模板，该引物只有在引物5端序列互补模板存在变异时，才会扩增模板，否则野生型抑制性rooptag上游引物不扩增。

5.根据权利要求2所述，常规野生型引物，没有tag和roop序列只扩增野生型模板。

6.根据权利要求2所述，常规下游引物，在SNP等变异区域5-10bp 处，该引物Tm值比上游引物高10度左右。

7.根据权利要求2所述，本发明PCR反应为2步：前15个循环为指数扩增期，退火温度为50-55℃，后面15个循坏为下游引物单引物线性扩增，退火温度为65-70℃。

8.根据权利要求2所述，野生型抑制性rooptag上游引物与常规野生型引物的浓度比在2:1-20:1之间，优选地，野生型抑制性rooptag上游引物与常规野生型引物的浓度比在5:1-10:1之间。

9.根据权利要求1所述,一种检测心血管疾病用药基因的试剂盒，其特征在于：所述11种基因17个突变位点的检测试剂含有SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3与SEQIDNO.4，SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9与SEQIDNO.10，SEQ ID NO.11与SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13与SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15与SEQID NO.16，SEQ ID NO.17与SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20，SEQ IDNO.21与SEQ ID NO.22，SEQ ID NO.23与SEQ ID NO.24，SEQ ID NO.25与SEQ ID NO.26，SEQIDNO.27与SEQ ID NO.28，SEQ ID NO.29与SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.31，SEQ ID NO.32与SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.34所示的引物对。