[发明专利]高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法

说明书

本发明公开了一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法，所述方法包括如下步骤：步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68，其保藏编号为：CGMCC No.21903；步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养或批次培养。本发明通过对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，筛选出一株能够高效分泌抗体的细胞株，并通过生物反应器进行放大培养，收获的半成品抗体含量高、质量稳定可控，减少了下游浓缩等耗时的步骤。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及利用生物反应器生产该抗体的方法。

背景技术

犬细小病毒病（CPVD）是由犬细小病毒引起的一种高度接触性传染病。该病可引起犬的急性肠炎及心肌炎，各年龄段犬均可感染，幼犬更易感染，且病死率高。该病不仅使犬主人经济受到损失同时还给心灵带来创伤，目前该病是养犬业重要的传染病之一。预防犬细小病毒病的方法主要是接种疫苗，对于患病犬的治疗方法主要是给发病早期的犬注射抗犬细小病毒血清或者注射抗犬细小病毒单克隆抗体，同时配合输液及注射犬的免疫球蛋白或者白蛋白等等，可有效降低该病的病死率。目前，治疗犬细小病毒病所用抗CPV免疫血清是由犬或者异源动物所制备，其质量不稳定，生产成本高，并且有携带外源病毒的风险，可引起严重的生物安全问题；而应用单克隆抗体治疗犬细小病毒病，不但能降低上述风险，并且治疗效果更佳，但现有的抗CPV单克隆抗体中和效价（抗病毒活性）低，半成品需要进行多倍浓缩后才能制成品，生产成本高、效率低。

发明内容

为了克服犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌抗体水平低、产品质量不稳定、生产效率低、生产成本高等问题，本发明提供了一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68及利用生物反应器对其进行生产的方法。本发明通过对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，筛选出一株能够高效分泌抗体的细胞株，并通过生物反应器进行放大培养，收获的半成品抗体含量高、质量稳定可控，减少了下游浓缩等耗时的步骤。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68，其分类命名为杂交瘤细胞（hybridoma），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.21903，保藏日期为2021年2月25日。

一种利用生物反应器生产高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株C68的方法，包括如下步骤：

步骤一、通过有限稀释法对犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株进行亚克隆；

步骤二、通过血凝抑制方法检测经亚克隆所得到的不同细胞株的效价，筛选出效价最高的细胞株C68，其效价为1:2560；

步骤三、将细胞株C68在生物反应器中进行连续培养，培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70 rpm，溶氧为40%，pH为6.85，每日收获抗体2L，可连续收获100天以上，收获的抗体效价为1:2560；或者细胞株C68在生物反应器中进行批次培养，批次培养条件为：温度为37℃，搅拌转速为70 rpm，溶氧为40%，pH为6.85，在流加第6~7天可全部收获，收获的抗体效价为1:2560。

本发明中，所述连续培养和批次培养均包括细胞生长阶段（即：培养细胞增殖）和抗体分泌阶段两个阶段，具体培养要求如下：

连续培养：种细胞在反应器中培养24小时后，细胞密度约为2.5*106个/ml时，开始进行流加培养，每24小时流进200ml流加培养基，每日从反应器内取样检测细胞密度、成活率并通过血凝抑制试验检测抗体效价，当效价达到1:2560时（多在流加第6~7天达到），开始收获细胞悬液，此时开启反应器的出液管道，将流速设置为每24小时收获2L，同时进行同流速补液，补液的成分为（基础培养基：流加培养基=3:1)；