[发明专利]一种产N-乙酰神经氨酸的重组微生物及其应用

说明书

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体公开了一种产N‑乙酰神经氨酸的重组微生物及其应用。本发明提供了一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的丙酮酸激酶的表达和/或酶活性；所述丙酮酸激酶为丙酮酸激酶I和/或丙酮酸激酶II；所述出发菌株为能够合成N‑乙酰神经氨酸的微生物。本发明的重组微生物与能够合成N‑乙酰神经氨酸的出发菌株相比，具有降低的丙酮酸激酶的表达和/或酶活性。其特别适于利用葡萄糖这一廉价低碳原料进行发酵培养生成N‑乙酰神经氨酸。本发明的重组微生物合成N‑乙酰神经氨酸发酵水平高，显著降低了N‑乙酰神经氨酸的生产成本，具有工业化潜力。

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种产N-乙酰神经氨酸的重组微生物及其应用。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是一种九碳醣衍生物，在动物体内构成细胞黏附的糖蛋白、寡糖基和大脑神经节苷脂糖链的重要组成。N-乙酰神经氨酸主要天然来源是母乳、牛奶、鸡蛋、奶酪和燕窝，其中又以燕窝中的神经氨酸含量较高，达7～12％，因此又被称“燕窝酸”。N-乙酰神经氨酸在一般食品中含量甚低，且水解后的神经氨酸单体到达人体器官的利用率相当低。因此，为满足功能代谢的需求，对于人体、特别是婴儿有必要进行外源性补充。目前N-乙酰神经氨酸已经广泛应用于婴儿配方食品，保健食品，化妆品等领域。

N-乙酰神经氨酸的生产方法主要包括天然产物抽提法、化学合成法、生物酶法和微生物发酵法。天然产物中N-乙酰神经氨酸含量低，产率低；化学合成反应条件严苛，易造成环境污染；全细胞生物酶以丙酮酸和乙酰氨基葡萄糖为原料，价格昂贵，且神经氨酸醛缩酶催化会可逆分解，反应结束后残留大量的丙酮酸致使产物分离遇到困难，使得转化率低，生产成本高。

利用葡萄糖作为廉价低碳原料直接发酵生产N-乙酰神经氨酸，反应条件温和，环境友好，对降低N-乙酰神经氨酸的生产成本以及拓展下游产品的应用范围和国际竞争力具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组微生物，其在发酵过程中能够利用葡萄糖作为廉价低碳原料直接发酵生产大量N-乙酰神经氨酸。

本发明在对微生物的N-乙酰神经氨酸代谢相关途径及其代谢流量进行预测分析的基础上，发现N-乙酰神经氨酸的前体磷酸烯醇式丙酮酸反应物浓度为影响N-乙酰神经氨酸产量的关键因素之一。而细菌独有的PTS转运系统，在摄取葡萄糖需同时消耗磷酸烯醇式丙酮酸，因此在代谢过程中，N-乙酰神经氨酸的前体磷酸烯醇式丙酮酸反应物浓度下降。结合实验发现基因敲除糖酵解最后一步的丙酮酸激酶基因，降低前体磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，能有效地提高N-乙酰神经氨酸的产量。

进而提出本发明的技术方案如下：

一种重组微生物，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的丙酮酸激酶的表达和/或酶活性；所述丙酮酸激酶为丙酮酸激酶I和/或丙酮酸激酶II；

所述出发菌株为能够合成N-乙酰神经氨酸的微生物。

所述丙酮酸激酶为两种构型的丙酮酸激酶I(pykF)和丙酮酸激酶II(pykA)，pykF基因和pykA基因为重组微生物自身基因组中所有。

本发明所指能够合成N-乙酰神经氨酸的微生物可为能够合成N-乙酰神经氨酸的野生型菌株(或其衍生菌株)，或者对本身不能合成N-乙酰神经氨酸的野生型菌株(或其衍生菌株)进行诱变或基因工程改造获得的菌株。

本发明的出发菌株对于其N-乙酰神经氨酸的产量高低没有特别限制，为获得高产N-乙酰神经氨酸的生产菌株，优选以具有相对较高N-乙酰神经氨酸产量的菌株作为出发菌。

优选地，所述重组微生物中丙酮酸激酶的两种构型编码基因同时失活，即可获得高产N-乙酰神经氨酸的重组微生物。来源于上述各种微生物的氨基酸序列以及编码基因序列均可通过NCBI等数据库获得。其中，来源于大肠杆菌的pykF和pykA编码基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。