[发明专利]一种产N-乙酰神经氨酸的重组微生物及其应用

权利要求书

1.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物与出发菌株相比，具有降低的丙酮酸激酶的表达和/或酶活性；所述丙酮酸激酶为丙酮酸激酶I和/或丙酮酸激酶II；

所述出发菌株为能够合成N-乙酰神经氨酸的微生物；

所述出发菌株为大肠杆菌，与其野生型菌株相比，具有提高的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶的表达和/或酶活性，并具有6-磷酸葡萄糖胺合成酶突变体；所述6-磷酸葡萄糖胺合成酶突变体相比于野生型6-磷酸葡萄糖胺合成酶包含E15K，D387V，S450P和E525G的突变；所述出发菌株与其野生型菌株相比，还具有降低的N-乙酰神经氨酸醛缩酶、N-乙酰神经氨酸转运蛋白、N-乙酰-6-磷酸甘露糖胺异构酶和N-乙酰甘露糖胺激酶的表达和/或酶活性；

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶和N-乙酰神经氨酸合成酶来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；所述野生型6-磷酸葡萄糖胺合成酶来源于大肠杆菌；

所述重组微生物的构建方法包括从出发菌株敲除pykF、pykA、nanA、nanT、nanE和nanK基因的步骤和将包含UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶、N-乙酰神经氨酸合成酶及6-磷酸葡萄糖胺合成酶突变体的编码基因的质粒导入出发菌株的步骤。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述表达和/或酶活性的降低通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：

(1)对目标酶的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得目标酶失活或活性降低；

(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件。

3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述表达和/或酶活性的提高和6-磷酸葡萄糖胺合成酶突变体的具备，通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：

(1)增加目标酶的编码基因的拷贝数；

(2)将目标酶的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更高的调控元件。

4.根据权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，所述增加目标酶的编码基因的拷贝数通过导入携带所述编码基因的质粒和/或在基因组上整合所述编码基因实现；

所述转录或翻译调控元件选自启动子、核糖体结合位点、增强子中的一种或多种。

5.权利要求1-4任一项所述的重组微生物的构建方法，其特征在于，包括从出发菌株敲除pykF、pykA、nanA、nanT、nanE和nanK基因的步骤和将包含UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶、N-乙酰神经氨酸合成酶及6-磷酸葡萄糖胺合成酶突变体的编码基因的质粒导入出发菌株的步骤。

6.权利要求1-4任一项所述的重组微生物的如下任一种应用：

（1）在发酵生产N-乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物中的应用；

（2）在用于生产N-乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物的微生物遗传育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述唾液酸化化合物为唾液酸化寡糖、唾液酸化酯、唾液酸化糖酯、唾液酸化蛋白质或唾液酸化苷元。

8.一种发酵生产N-乙酰神经氨酸或唾液酸化化合物的方法，其特征在于，包括培养权利要求1-4任一项所述的重组微生物的步骤。