[发明专利]一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶及其制备方法

权利要求书

1.一种用于肝癌治疗修复一体化的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将新鲜动物肝脏反复冻融，切片后用去离子水反复洗涤，然后用氨水和Triton X-100的混合溶液进行脱细胞处理，再用去离子水磁力搅拌洗涤至中性后，用pH=7.4的PBS溶液浸泡过夜，得到脱细胞支架前体P-DECM；

（2）将步骤（1）制得的P-DECM冷冻干燥后剪碎，−20~4 ℃下低温研磨，得到细胞外基质粉末F-DECM；

（3）将步骤（2）得到的F-DECM加入到含有胃蛋白酶的盐酸溶液中，在合适的温度下搅拌至完全溶解，然后加入氢氧化钠溶液调节pH值至中性，加入10×PBS调节渗透压至平衡，得到肝脏细胞外基质水凝胶前体H-DECM；

（4）将氯金酸溶液与柠檬酸钠于锥形瓶中混合搅拌均匀，然后在所得金溶液中加入冰冷的硼氢化钠溶液，搅拌反应得到纳米金溶液后离心，冷冻干燥，得到金纳米颗粒GNPs；

（5）将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、叠氮磷酸二苯酯、DSPE-PEG2000-COOH和GNPs溶于甲醇和氯仿的混合溶液中，超声混匀，经过旋蒸成膜，得到脂质体囊泡包裹的纳米材料前体P-GNBs；

（6）将甘油、1×PBS和嵌段式聚醚F-68混合得水合液；

（7）将步骤（6）得到的水合液加入到步骤（5）得到的P-GNBs中，超声使脂质体膜溶解，得到脂质体囊泡包裹的纳米粒子GNBs溶液；将抗癌药物加入到GNBs溶液中，于油浴条件下，在全氟丙烷气氛中震荡反应后离心、洗涤，37 ℃下干燥，称重，得到载药纳米材料GNBs/ACD；

（8）将步骤（3）得到的H-DECM与步骤（7）得到的载药纳米材料GNBs/ACD在冰浴上快速搅拌混合均匀，后经过程序升温，最终保持在37 ℃下自主交联，得到所述多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶GNBs/ACD/H-DECM。

2. 根据权利要求1所述的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述氨水和Triton X-100的混合溶液中，氨水的体积浓度为0.01%~20%，TritonX-100的体积浓度为0.1% ~30%。

3. 根据权利要求1所述的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中将P-DECM剪碎为直径1 µm~3 cm的颗粒，再研磨成直径10 nm~1 mm的粉末。

4. 根据权利要求1所述的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述含有胃蛋白酶的盐酸溶液中盐酸的浓度为0.00001~10 M，胃蛋白酶的浓度为0.01~1000 mg/mL；F-DECM的加入量为0.01~1000 mg/mL；所述搅拌的温度为0~60 ℃，时间为2 h~7 d；所述氢氧化钠溶液的浓度为0. 0001~100 M。

5. 根据权利要求1所述的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（4）所得金溶液中氯金酸的浓度为0.001~250 mM，柠檬酸钠的浓度为0.001~250mM；所用硼氢化钠溶液的浓度为0.1 M，其用量与金溶液的体积比为(0.001~15):20，所述搅拌反应的时间为10 min~ 4 h；所得GNPs的粒径为1~100 nm。

6. 根据权利要求1所述的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述甲醇和氯仿的混合溶液中甲醇和氯仿的体积比为(0.1~200):1；二棕榈酰磷脂酰胆碱的加入量为0.002~10 mg/mL，二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺的加入量为0.002~10mg/mL，叠氮磷酸二苯酯的加入量为0.002~10 mg/mL，DSPE-PEG2000-COOH的加入量为0.002~10 mg/mL，GNPs的加入量为0.002~100 mg/mL。

7. 根据权利要求1所述的多功能肝脏细胞外基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（6）所得水合液中甘油与1×PBS的体积比为(0.00001~100):1，F-68的含量为0.005~50 mg/mL。