[发明专利]提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株

说明书

本申请公开了一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株。通过外源质粒的启动子使用Tet‑on系统，利用同源重组在黑曲霉糖化酶高产的尿嘧啶缺陷型(pyrG‑)菌株上进行整合，使得酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种过表达，通过脂肪酸代谢途径的调控大大提高了黑曲霉的糖化酶生产能力。

技术领域

本申请涉及生物工程技术领域，具体涉及一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株。

背景技术

葡萄糖水解酶(Glucoamylase,E.C.3.2.1.3.)也被称为糖化酶(amyloglucosidase),是一种一条肽链的酸性糖蛋白酶，具有外切活力，能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物碳链上的1,4糖苷键连接的非还原端，终产物是β-D-葡萄糖，也可水解α-1,6和α-1,3糖苷键，只是相对水解速度较慢。葡萄糖淀粉酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，自上世纪70年代黑曲霉来源的葡萄糖淀粉酶被首次纯化出来后，它便被广泛地应用于淀粉糖、食品、医药、酿造等工业生产中，是世界上仅次于蛋白酶的第二大类酶制剂，占全球酶制剂交易市场的25-33％。目前，工业上糖化酶的生产主要是由Aspergillus和Rhizopu属发酵制取。构建糖化酶基因的高拷贝工程菌，异源表达以及糖化酶发酵培养基和工艺的优化，如优化培养温度，pH，菌丝体大小，通气，搅拌以及反应器的类型，是提高糖化酶工业化生产的主要手段，寻找新的糖化酶或通过蛋白工程改造提高现有糖化酶的催化效率是近年来主要的研究方向。

黑曲霉(Aspergillus)是一种常见的丝状真菌，因其强大的蛋白质分泌能力和良好的安全性被广泛用于多种酶制剂的生产。随着基因组学技术的日益发展和成熟，黑曲霉的基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等组学数据不断增长。黑曲霉作为生产工业用酶的重要生产菌株，深入研究其高效产酶机制和分泌机制具有重要的现实意义。目前，转录组学分析广泛地应用于分析不同环境变量，不同产酶水平菌株之间产酶量差异的关键因素，寻找起到关键调控作用的基因或基因簇，为后续的菌种改造提高黑曲霉产酶性能提供潜在的靶点。

黑曲霉的研究主要从蛋白分泌途径改造、菌丝形态、增强产酸能力、代谢调控等方面开展，但是极少的研究从脂肪酸代谢的角度对黑曲霉细胞工厂进行优化。

发明内容

本申请提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法及重组黑曲霉菌株，通过黑曲霉中脂肪酸代谢调控基因的过表达可有效提高黑曲霉的糖化酶生产能力。

本申请提供如下技术方案：

第一方面，本申请提供一种提高黑曲霉糖化酶生产能力的方法，包括：在黑曲霉菌株中导入基因表达调控元件，使所述黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。

在一些实施方案中，所述脂肪酸代谢途径调控基因是酰基辅酶A脱氢酶编码基因、乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因或细胞色素P450单加氧酶编码基因中的至少一种。

在一些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶编码基因为An14g03240基因(GENE ID:4987180)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶编码基因为An04g05720基因(GENE ID:4990979)；所述细胞色素P450单加氧酶编码基因为An03g06460基因(GENE ID:4980633)。

在一些实施方案中，所述基因表达调控元件为Tet-on系统调控元件。

在一些实施方案中，所述方法包括：将所述脂肪酸代谢途径调控基因插入到含有可诱导表达Tet-on系统的质粒中，并导入黑曲霉菌株，使所述脂肪酸代谢途径调控基因在所述黑曲霉菌株中过表达。

第二方面，本申请进一步提供一种糖化酶生产能力提高的重组黑曲霉菌株，所述重组黑曲霉菌株中至少一种脂肪酸代谢途径调控基因过表达。