[发明专利]一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，属于医疗技术领域。本发明提供的一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：S1.合成克百威半抗原；S2.制备克百威免疫原；S3.制备克百威包被原；S4.制备克百威单克隆抗体；S5.制备酶标二抗；S6.制备酶标板；S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度。本发明提供的一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，能够快速对克百威进行检测，具有灵敏度高、特异性好、准确度高等优点。

技术领域

本发明是一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，属于酶联免疫检测技术领域。

背景技术

克百威，化学名称为2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃-N-甲基氨基甲酸酯，其作为杀虫剂广泛用于防治棉花、花生、烟草和大豆等作物害虫。克百威杀虫效果好，但是对人和野生动物的毒性很高，在粮食和蔬菜上过量使用克百威会对人体健康造成伤害，并且污染土壤和地下水源，造成环境污染。

目前，检测克百威残留的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和液-质联用法(HPLC-MS)，这些检测方法虽然灵敏准确，但是成本高、费时长。酶联免疫分析(ELISA)方法具有样品容量高、检测速度快、成本低等优点，酶联免疫分析试剂盒的质量很大程度上由抗原和抗体的性能决定，敏感性强和结合速度快的抗体有利于提高试剂盒的灵敏度和特异性。

CN107462715B公开了一种克百威和异丙威双联检免疫荧光试纸条和试剂盒及其应用，其中，试纸条包括底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上按样品流动方向从前到后依次具有结合有克百威半抗原-载体蛋白偶联物的第一检测线、结合有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的第二检测线以及结合有羊抗鼠多克隆抗体的质控线，本发明还提供了装有上述试纸条的试剂盒及试剂盒在同时检测样品中克百威和异丙威的残存中的应用。本发明提供的克百威和异丙威双联检免疫荧光试剂盒可以同时实现克百威和异丙威残留的检测，检测准确性高，具有高灵敏度、高特异性的特点，能够实现简单快速检测，操作简便，适合于大规模筛选。

检测克百威时，合成的克百威半抗原的纯度对相应抗原和抗体的性能产生，从而影响了试剂盒检测克百威的特异性和灵敏度。

发明内容

针对现有技术存在不足，本发明的目的是提供一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒，能够快速对克百威进行检测，具有灵敏度高、特异性好、准确度高等优点。

为了实现上述目的，本发明提供了一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：S1.合成克百威半抗原；S2.制备克百威免疫原；S3.制备克百威包被原；S4.制备克百威单克隆抗体；S5.制备酶标二抗；S6.制备酶标板；S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度；

步骤S4包括以下步骤：将步骤S2得到的克百威免疫原注入小鼠体内使其产生抗血清前，利用BSA对小鼠进行初次免疫，之后取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，测定细胞上清液，筛选阳性孔，对阳性孔进行克隆化，得到分泌克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

采用上述方案，先利用BSA对Balb/c小鼠进行初次免疫，使后注入Balb/c小鼠体内的克百威免疫原更容易产生免疫应答，在细胞融合和克隆化过程中，取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，使步骤S4制备的克百威单克隆抗体敏感性提高，结合速度加快，从而提高了此检测方法的灵敏度、特异性和准确度。

优选的，步骤S4还包括以下步骤：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成0.5-2×10⁵个/mL的细胞悬液，在液氮中保存，经复苏、培养、采集腹水、纯化后，冷冻保存。

优选的，步骤S4中，小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为8-12:1。

优选的，步骤S4中，BSA和克百威免疫原的注射量为110-130μg/只。