[发明专利]一种检测克百威的ELISA方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测克百威的ELISA方法，包括以下步骤：S1.合成克百威半抗原；S2.制备克百威免疫原；S3.制备克百威包被原；S4.制备克百威单克隆抗体；S5.制备酶标二抗；S6.制备酶标板；S7.建立克百威标准品浓度相对吸光度的标准曲线，根据标准曲线和待测样品的吸光度推算待测样品中克百威的实际浓度；

其特征在于，步骤S4包括以下步骤：将步骤S2得到的克百威免疫原注入小鼠体内使其产生抗血清前，利用BSA对小鼠进行初次免疫，之后取小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞融合，测定细胞上清液，筛选阳性孔，对阳性孔进行克隆化，得到分泌克百威单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S4还包括以下步骤：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成0.5-2×10⁵个/mL的细胞悬液，在液氮中保存，经复苏、培养、采集腹水、纯化后，冷冻保存。

3.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S4中，小鼠的脾细胞与FO骨髓瘤细胞的数量比为8-12:1。

4.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S4中，BSA的注射量为110-130μg/只。

5.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1中，克百威半抗原的合成步骤如下：

1)以呋喃酚、氯甲酸对硝基苯酯为原料，以二氯甲烷为溶剂，同时加入三乙胺，合成中间体，合成路线如下；

2)将步骤1)得到的中间体和氨基丁酸为原料，以四氢呋喃和饱和碳酸钠溶液为溶剂，合成克百威半抗原，合成路线如下：

6.根据权利要求5所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1的步骤1)中，呋喃酚与三乙胺的用量比为10-15mg:2-7μL。

7.根据权利要求5所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1的步骤1)中，将呋喃酚和氯甲酸对硝基苯酯分别溶于二氯甲烷后再进行反应，其中，呋喃酚与二氯甲烷的用量比为10-15mg:1-4mL，氯甲酸对硝基苯酯与二氯甲烷的用量比为12-18mg:2-5mL。

8.根据权利要求5所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S1的步骤2)中，将氨基丁酸溶于饱和碳酸钠溶液，中间体溶于四氢呋喃溶液后，再进行反应，氨基丁酸的用量为1-5mg，饱和碳酸钠溶液的用量为1-5mL，中间体的用量为2-8mg，四氢呋喃的用量为1-5mL。

9.根据权利要求1所述的一种检测克百威的ELISA方法，其特征在于，步骤S2具体为，将步骤S1制备的克百威半抗原溶于DMF中，加入碳二亚胺盐酸盐，搅拌，加入溶解有BSA的PBS缓冲液，继续反应，离心后用PBS透析，得到克百威免疫原。

10.一种检测克百威的ELISA试剂盒，其特征在于，采用权利要求1-9任一所述的检测克百威的ELISA方法。