[发明专利]一类亲脂性含有癸酸酯结构的罗丹明pH荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一类亲脂性含有癸酸酯结构的罗丹明pH荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构通式如(Ⅰ)所示。用罗丹明B与三氯氧磷反应制备罗丹明B酰氯，再与丝氨醇制备罗丹明B丝氨醇，随后将其溶解于干燥的二氯甲烷中，加入N,N‑二异丙基乙胺、4‑二甲氨基吡啶和癸酰氯，室温搅拌36‑48小时，经硅胶柱层析提纯，分别制得RK‑1和RK‑2荧光探针。该探针均具有较好的溶解性和pH可逆性(3.0‑9.0)，吸光度和荧光强度均不受金属离子的干扰。长脂肪连有助于其进入亲脂性的环境中，能够定位于细胞的细胞膜上。此外，大型蚤成像实验表明这类探针具有较好的微生物染色性，能够对大型蚤及其酸性消化道进行荧光成像。

技术领域

本发明涉及罗丹明pH荧光探针，特别涉及亲脂性含有癸酸酯结构的罗丹明pH荧光探针及其应用。

背景技术

物质的跨膜运输是维持细胞正常生命活动的基础之一，包括透过脂膜的简单扩散和通过载体及通道来转运等，脂膜一般指具有磷脂双分子层结构或其他脂溶性物质的膜结构，包括细胞膜，角质层等。细胞膜由磷脂双分子层及镶嵌在其上的蛋白质载体构成。维持细胞之间的跨膜运输的膜转运蛋白主要分为载体蛋白和通道蛋白。这一类蛋白是由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性内核和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒。其中通道蛋白是跨膜运输的亲水通道，允许适当大小的离子通过。在脂膜的离子通道中，质子通道维持着细胞内环境的稳定，同时保持着胞液中各类细胞器pH的稳定。为了便于研究膜上pH通道在质子传递过程中所发挥的重要作用，急需研发质子通道可视化的荧光成像试剂。荧光探针是能够满足上述要求的最优选择，其具有操作简单、可视化强、灵敏度高、可以实现微环境检测、不会破坏样品等优点。此外，因其对细胞没有损害性，而且具有高选择性、便捷的可视化成像的特性，与其他技术相比具有着显著的优势。为了研究细胞膜上的H⁺通道和水蛋白在细胞内pH调控过程中的作用，研发具有亲脂性膜定位的高灵敏度、强抗干扰及具有较窄的pH响应窗口的荧光探针，并将其用于细胞膜和大型蚤的荧光成像，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一类亲脂性含有癸酸酯结构的罗丹明pH荧光探针，该罗丹明pH荧光探针可以定位于细胞膜并快速响应、高灵敏度检测大型蚤体内pH的变化。

本发明采用的技术方案是：一类亲脂性含有癸酸酯结构的罗丹明pH荧光探针，具有通式(Ⅰ)的结构，

其中，

一类亲脂性含有癸酸酯结构的罗丹明pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)取罗丹明B与三氯氧磷，以1,2-二氯乙烷为溶剂，90℃下加热回流反应3-5小时，蒸掉溶剂1,2-二氯乙烷，制备罗丹明B酰氯；

2)于步骤1)所得罗丹明B酰氯中，加入丝氨醇、三乙胺、乙醇和乙腈的混合溶液，室温下搅拌24小时，经硅胶柱层析提纯，制备罗丹明B丝氨醇；

3)将罗丹明B丝氨醇溶解于干燥的二氯甲烷中，依次加入N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶和癸酰氯，室温搅拌36-48小时，所得反应物用二氯甲烷萃取，取下层有机相，干燥有机相，所得产物经硅胶柱层析提纯。

优选地，上述的制备方法，所得产物经硅胶柱层析提纯，具体为，将产物注入硅胶柱中，以体积比为10:1的二氯甲烷和乙酸乙酯混合物为洗脱剂进行洗脱获得产物RK-1；所述产物RK-1的结构式如(Ⅱ)所示，

优选地，上述的制备方法，所得产物经硅胶柱层析提纯，具体为，将产物注入硅胶柱中，以体积比为5:1的二氯甲烷和乙酸乙酯混合物为洗脱剂进行洗脱获得产物RK-2；所述产物RK-2的结构式如(Ⅲ)所示，

优选地，上述的制备方法，按摩尔比，罗丹明B丝氨醇:N,N-二异丙基乙胺:4-二甲氨基吡啶:癸酰氯＝1:10:0.3:4。