[发明专利]一种含有外泌体的生发液的制备方法

权利要求书

1.一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备脐带提取物；

S11、清洗脐带；

S12、剪断脐带，并放入培养基中进行培养；

S13、过滤组织液，并提取上清液，得到脐带提取物；

S2、提取外泌体；

S21、首先剥离血管，然后进行培养组织，最后进行消化冻存；

S22、取细胞培养，然后取其上清液，接着进行离心，再进行重悬沉淀，最后储存备用；

S3、制备生发液；

S31、将步骤S2中提取的外泌体使用步骤S1中的脐带提取物进行重悬，即可制备成含有外泌体的生发液；

S32、制备完成之后，对其进行保存。

2.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S11的具体操作为：首先采用HBSS将脐带上的血迹清洗干净，然后采用酒精将其浸泡3分钟，再用HBSS将其表面的酒精清洗干净。

3.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S12的具体操作为：首先将步骤S11中得到的脐带剪成2-3cm的小段，然后用眼科剪将脐带剪成4mm左右大小的组织块，接着将组织块转移到50ml的离心管中，并添加20ml无血清培养基，然后将其置于4摄氏度的环境下培养72h。

4.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S13的具体操作为：收集经过步骤S12中培养72h之后的培养基的上清液，并用细胞筛过滤掉组织块，然后将收集到的上清液置于-80摄氏度进行保存，即为脐带提取物。

5.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S21的具体操作为：首先将脐带剪成2-3cm的小段，然后在横切面用剪刀剪一个小切口，沿着切口将羊膜慢慢去掉，然后进行血管的剥离，待血管剥离干净后，将剩余组织全部转移到一个新的培养皿内，这些组织便是华通氏胶，接着加入少量无血清培养基，用眼科剪将华通氏胶剪成4mm左右大小的组织块，然后将组织块转移到培养瓶中，并添加无血清培养基进行培养，同时每隔2天进行全量换液，7天左右，观察到有细胞从组织边缘爬出，待细胞融合度达到80％-90％时，即可进行消化冻存。

6.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S22的具体操作为：首先取第4代的细胞，用无血清培养基培养48h后，收集其上清液，然后300g离心10min，再2000g离心20min，即可去除细胞和凋亡小体，接着10000g，4℃离心30min，即可去除碎片和微泡，最后收集其上清液，4℃，并100000g离心60min，即可沉淀外泌体样胞外囊泡，离心完毕之后，用500μl脐带提取物进行重悬沉淀，并将其置于-80摄氏度的环境中进行储存备用。

7.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S31中需要将外泌体按照5×10⁹/mL用脐带提取物进行重悬。

8.根据权利要求1所述的一种含有外泌体的生发液的制备方法，其特征在于，所述步骤S32中保存的环境温度为-80摄氏度。