[发明专利]一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法

说明书

本发明公开了生物医药技术领域的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，包括对小鼠小肠进行细胞分离和细胞培养，该体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，可以模仿动物的不同生长期进行观察或进行各种药物实验、毒性实验，从而进一步实现对机体的机理研究、病因学及发病机制等疾病基础研究、新药筛选、肠道疾病精准治疗的临床前评价、与肠道微生物的关系研究、疾病预测、预防研究等。本发明无需基质胶包被等特殊处理，仅需通过普通培养瓶和一般采用的培养基培养，操作方法简单。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法。

背景技术

采用细胞株进行平面培养(2D培养)的研究有着庞大的研究数据作为参考，然而其在组织、器官乃至生命体的机理研究方面以及药物研发、临床应用方面存在与体内机体环境巨大差别的局限性。在生理学环境下，多种细胞需要互相“交流”以及受到细胞基质(ECM)的影响，发生不同细胞的基因转录、受体表达、细胞转移、程序性死亡等复杂的生物学机能。

类器官是由多系细胞组成的体外三维培养物，是由干细胞驱动而以自组织的方式而构建形成，能够模拟天然器官结构和功能。与传统二维培养物相比，类器官更能模拟体内细胞运动及多细胞间信号交流，且能在扩增中维持基因稳定性。与动物实验相比，类器官能模拟动物实验易或不能准确代表的人体发育和疾病的发生发展过程，并可实现实时成像和更为符合实验伦理要求，这对病情的进展、药物研发、临床研究方面都会起到很大推动作用。

但是到目前为止，世界上还没有利用包括人在内的动物的小肠组织直接培养出类似体内能蠕动的器官(类器官)。这个能蠕动的组织是小肠平滑肌组织，自律蠕动，单独培养的平滑肌细胞不会形成蠕动现象，而需要在粘膜上皮细胞、神经细胞等支持下才能发生蠕动现象，这归因于小肠的分节运动以及蠕动主要受局部的肠神经系统调节，而对中枢神经系统具有相对独立性。

目前采用的小肠平滑肌体外实验，主要是利用小肠平滑肌组织(与周围组织)进行药敏试验等，缺点是不能长期观察或者药敏试验，其需要基质胶包被等特殊处理，培养难度大，操作复杂。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，包括如下步骤：

步骤1：取三只生后一周的c57BL小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；

步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有PBS的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；

步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；

步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；

步骤5：用1xPBS缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm³的组织碎块，并转移到50mL的离心管中；

步骤6：用1xPBS清洗两次后，用300g的离心力进行离心，直至完全去除PBS；

步骤7：加入Ⅱ型和Ⅳ胶原酶进行消化；

步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；

步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：

1)用剪刀剪除1mL枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。

2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xPBS缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。

3)加入1xPBS缓冲液至40mL；

步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；