[发明专利]一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法

权利要求书

1.一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤1：取三只生后一周的c57BL小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠，在70％酒精中浸泡1min消毒；

步骤2：在超净工作台内解剖小鼠，取出所有大肠与小肠，放到装有PBS的100mm培养皿当中，去掉大肠部分；

步骤3：用眼科剪刀，顺着小肠纵向剪开小肠；

步骤4：用弯头眼科镊的弯曲的凸面一侧轻轻刮掉小肠内部残留物以及大部分小肠粘膜上皮；

步骤5：用1xPBS缓冲液清洗2-3次。去掉清洗上清液后，用眼科剪把小肠组织剪成小于1mm³的组织碎块，并转移到50mL的离心管中；

步骤6：用1xPBS清洗两次后，用300g的离心力进行离心，直至完全去除PBS；

步骤7：加入Ⅱ型和Ⅳ胶原酶进行消化；

步骤8：放入温度为4℃，避光消化16小时；

步骤9：取出后，在超净工作台或生物安全柜内操作：

1)用剪刀剪除1mL枪头前部的移液器来吹打消化的小肠组织。

2)用孔径为100um的过滤网进行过滤，然后用1xPBS缓冲液冲洗过滤网上部的残余细胞。

3)加入1xPBS缓冲液至40mL；

步骤10：再次进行离心操作，设置离心力为500g，时间为5min；

步骤11：在超净台或安全柜内，去掉上清液后，加入1xPBS缓冲液至40mL，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；

步骤12：去掉上清液后，加入含10％血清的DMEM/F12完全培养基至40mL，重悬后进行离心操作，设置离心力为300g，时间为5min；

步骤13：加入含10％血清的DMEM/F12完全培养重悬步骤12中离心后的沉淀细胞，用移液器转移到已经装有5mL含10％血清的DMEM/F12完全培基的T25培养瓶中；

步骤14：把步骤13的T25培养瓶放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

步骤15：40-48h后，细胞长满整个瓶底(覆盖度达到100％)；

步骤16：完全去掉T25瓶中的培养上清液，更换6mL成神经元完全培养基(专用基础培养基加B27、N2两种神经元生长因子，B27添加比例为2％，N2添加比例为1％)；

步骤17：每间隔两天全部去掉步骤16中的神经元完全培养基，更换6mL神经元完全培养基(以下更换培养基时的更换了都为6mL)；

步骤18：从分离细胞开始培养算起，第10-14天开始培养的组织(类器官)开始出现蠕动，从此时开始，每间隔4天开始更换一次神经元完全培养基。

2.根据权利要求1所述的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：所述步骤7中Ⅱ型和Ⅳ胶原酶的总体积是组织量3倍，Ⅱ型和Ⅳ胶原酶的终浓度均为0.1mg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：培养的细胞为以平滑肌细胞和上皮细胞为主的混合细胞，完全为小肠组织内的各种细胞组成。

4.根据权利要求1所述的一种体外分离、培养能蠕动的小鼠小肠类器官的方法，其特征在于：在培养箱外观察、拍照、以及换液的时间不超过6分钟；配制的完全培养基不超过两周；更换的新的培养基预热到20℃-37℃之间。