[发明专利]高热稳定性高活性异丁香酚单加氧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种异丁香酚单加氧酶突变体及其应用，属于生物工程领域。将来源于硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)Jin1的异丁香酚单加氧酶基因进行定点突变，使其编码的氨基酸序列在第83位由赖氨酸K突变为精氨酸R，第95位由赖氨酸K突变为精氨酸R，第273位由亮氨酸突变为苯丙氨酸F。本发明所述的异丁香酚单加氧酶突变体K83R/K95R/L273F的比活是突变之前的2.1倍，在25℃、30℃、35℃下半衰期分别提高了3.0倍、12.0倍、24.7倍。本发明的异丁香酚单加氧酶突变体在氧气作用下可以在较宽的温度范围内催化底物异丁香酚苯环上的丙烯基氧化从而生成香兰素，能广泛应用于食品、化工、制药等行业，具有广阔的前景。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高热稳定性高活性异丁香酚单加氧酶突变体及其应用。

背景技术

异丁香酚单加氧酶(Isoeugenol Monooxygenase)简称IEM，以异丁香酚为底物，在无需任何辅酶和辅因子的存在下，通过氧化裂解连接苯环的丙烯基从而生成香草醛。而香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)又名香兰素，由于其独特的香气和性质，被广泛应用于食品、化工和医药等领域。香兰素在食品中可以作为调味剂加入至蛋糕、冰激凌中以增强其香气和风味；在化工行业中常用于检验间苯二酚、单宁酸的存在；在制药行业中也是许多药物的生产原料和重要中间体，例如其可用于制备多巴胺、抗癫痫药等(黄希顺，黄丽娟，魏建科.香草醛治疗癫的疗效观察[J].实用神经疾病杂志.2005,8(4):78.)。

目前市场上的香兰素大多数都是化学法合成的，经研究发现，使用大剂量化学法合成的香兰素会导致头痛、呕吐、呼吸困难等不良反应，对人体危害较大。因此近年来，消费者们对于天然香料的呼声越来越高，导致天然香兰素的需求量也在大幅增长。而天然香兰素主要存在于香荚兰豆中，可通过超临界CO₂萃取技术进行提取，但该方法提取出的天然香兰素价格非常昂贵，无法满足市场需求(符史良，周江，黄茂芳，等.超临界CO₂萃取香草兰的工艺研究和成分分析[J].食品与机械.2002,(2):12-14.)。随着生物催化技术的迅速发展，其可在较短的时间内进行高效、快速的反应，并且拥有绿色环保、选择性和专一性强等优点，使得该方法更适合商业化生产。

异丁香酚是合成香兰素的最佳前体物质，而IEM是生物转化异丁香酚的唯一关键酶，该方法合成出来的香兰素在香气上最接近于天然香兰素，因此引起广泛的关注。

蛋白质工程中的理性设计是基于对目的蛋白的序列、结构、催化机制等酶学信息有一定的了解下，借助各类生物信息学软件，预测不同位点的突变对于目的蛋白稳定性和催化性能等方面的影响。全质粒PCR法是目前应用最广泛的定点突变方法之一，具有操作简便、快速、高效等优点。对已报道微生物来源的IEM研究发现，主要围绕外源表达、酶学性质的研究居多(Yamada M,Okada Y,Yoshida Y,et al.Vanillin production usingEscherichia coli cells over-expressing isoeugenol monooxygenase ofPseudomonas putida[J].Biotechnology Letters.2008,30(4):665-670.)，而针对分子改造方面的研究较少。中国专利申请CN 106754802 B公开了一种异丁香酚单加氧酶突变体及其应用，属于生物技术领域，针对产物抑制的问题，对异丁香酚单加氧酶基因进行定点突变，最终获得了催化活性比亲本至少高出117％的突变酶，然而，该异丁香酚单加氧酶突变体不具有高热稳定性。因此，本发明首次针对该酶热稳定性差的问题，借助生物信息学软件对其进行定点突变，并且在提高热稳定性的同时还进一步提高了异丁香酚单加氧酶的催化活性。