[发明专利]一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法

说明书

本发明公开了一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，该方法包括：(1)摇瓶培养筛选：将活化后的亲本灵芝菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出生物活性指标与亲本相当的摇瓶发酵液备用；(2)平板培养筛选：将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液复接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；(3)摇瓶培养验证：将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株。应用本发明的方法可有效解决灵芝菌株在液态培养的传代过程中导致的菌种退化，菌种活力弱，菌种质量差的问题，为灵芝菌株的液态规模化可持续性发酵生产提供了菌种保障。

技术领域

本发明涉及微生物菌种选育技术领域，具体的说涉及一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法。

背景技术

灵芝为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是我国名贵的药用真菌之一。始载于汉代《神农本草经》，具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿、维持机体平衡等功效。近年来，灵芝得到国内和国外许多学者的深入研究。现阶段获取灵芝活性成分材料的方法有三种，一是野外子实体或人工栽培的子实体，二是灵芝孢子，三是发酵菌丝体和发酵液。与人工栽培灵芝相比，通过发酵技术生产灵芝活性物质具有菌丝增殖速度快，不受季节影响、生产周期短、活性成分含量相对稳定等特点，现已成为获取质量稳定的灵芝活性物质的一种新型而重要的技术手段，得到了国内外学者们的广泛关注。

近年来，灵芝液态深层发酵研究大多集中在发酵培养基，发酵条件优化和发酵产物特性及成分的分析等方面，注重于提高灵芝多糖等活性物质的产量，对适用于液态发酵专用灵芝菌株的研究较少。目前，灵芝液态发酵用菌株多是通过自然选育的，许多灵芝菌株的性状不稳定，在经过几代传代培养后容易退化、老化，使得这些灵芝菌株的优质性状很难长久保持。

因此，目前迫切需要一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，该方法包括如下步骤：

(1)摇瓶培养筛选：

将活化后的亲本菌株的灵芝菌丝体转接入摇瓶培养，筛选出生物活性指标与亲本相当的摇瓶发酵液备用；

其中，摇瓶培养基的配方如下(单位：g/L)：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8；

(2)平板培养筛选：

将摇瓶筛选获得的与亲本生物活性指标相当的发酵液反接入平板进行培养，挑选出生长速度快的平板备用；

其中，平板培养基的配方如下(单位：g/L)：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8，琼脂10-20；或使用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA培养基)平板；

生长速度是指灵芝菌丝体长满平板所用的时间；

(3)摇瓶培养验证：

将上述备用平板上培养好的灵芝菌丝体转接入摇瓶进行传代培养验证，生物活性指标与亲本相当且传代稳定的摇瓶发酵液所用的平板菌株即为复壮的灵芝菌株；

其中，摇瓶筛选配方如下(单位：g/L)：葡萄糖10-50，酵母粉2-10，磷酸二氢钾1-8，七水硫酸镁1-8；

传代稳定是指每传一次的菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率的波动范围在10％以内；

其中上述步骤(1)、(2)、(3)中的生物活性指标均包括菌丝体得率和底物葡萄糖的利用率。

其中亲本菌株来源：选择传代次数少于3次的保藏灵芝菌株。其中，灵芝保藏菌株来自于组织分离获得的原始灵芝菌株，传代次数少于3次(包括3次)。

具体的说，本发明的液态发酵专用灵芝菌株的复壮方法，包括如下步骤：