[发明专利]一种检测游离睾酮的方法及试剂盒

说明书

本发明属于激素检测技术领域，涉及一种检测游离睾酮的方法及试剂盒。针对现有技术中游离睾酮检测时所需样本体积大、样品需要衍生化处理、检测耗时长、检测精确度不高和检测下限难以突破的技术问题，本申请提供一种检测游离睾酮的方法，将检测样品超滤、固相萃取再进行高效液相色谱串联质谱分析，用检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归，计算游离睾酮含量，本方案所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、检测限低。本申请还提供了一种用于游离睾酮检测的试剂盒，使检测步骤简化。

技术领域

本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种检测游离睾酮的方法及试剂盒。

背景技术

睾酮在人体的睾酮正常值要根据男女性别来决定，同时也要根据年龄来决定，成年人男性一般是在14～25.4nmol/L，而成年女性则是在1.3～2.8nmol/L。如果是男性儿童，一般是大于8.8nmol/L，而女性儿童一般大于0.7nmol/L。在女性和儿童体内的含量总浓度非常低，比正常男性低一个数量级，而游离的睾酮只占总量的2％不到，因此，要求游离睾酮的体内检测方法具有更高的灵敏度。游离的睾酮含量比总的睾酮更具有临床上的诊断意义，测定男性体内游离睾酮水平可代表生物活性睾酮水平的高低，游离睾酮在调查老年男性的雄激素状态方面具有更大的信息，更适合用于研究女性的雄激素过剩、性腺功能障碍、男性的性发育和青春期障碍，多囊卵巢综合征，以及监测雌激素治疗的反应等。血清中游离睾酮的含量很低，所以前处理过程必须能够从血清基质中高效提取目标物，并在保留、浓缩目标物的前提下去除尽可能多的杂质，减少干扰。

临床生物样品中内源性激素的测定方法主要采用放射免疫分析法和化学发光免疫法等免疫分析法，如中国专利申请公布号CN109633180A，发明名称为“一种游离睾酮化学发光检测试剂盒及其制备方法”，公开了一种游离睾酮化学发光检测试剂盒及其制备方法，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；R1试剂包括缓冲液I和链霉亲和素磁珠，链霉亲和素磁珠在缓冲液Ⅰ中的浓度为0.05～0.2％；R2试剂包括化学发光标记物标记的游离睾酮-牛血清白蛋白和缓冲液Ⅱ，化学发光标记物标记的游离睾酮-牛血清白蛋白在缓冲液Ⅱ中的浓度为50～100ng/mL；R3试剂包括生物素标记的游离睾酮抗体和缓冲液Ⅲ，生物素标记的游离睾酮抗体在缓冲液Ⅲ中的浓度为150～500ng/mL。该方案由于免疫分析法中同一抗体可能与多种抗原发生反应，导致其灵敏度与特异性和准确度都不足，准确度与精密度很差。

目前国内外关于体内定量分析游离睾酮的文献报道较少，通常测的都是总的睾酮的含量，一般采用气质联用的方法来检测，如中国专利申请公布号CN109633041A，发明名称为“衍生化HPLC法测定药物中双氢睾酮的方法”，公开了一种衍生化HPLC法测定药物中双氢睾酮的方法，包括以下步骤：以苯甲酰卤类化合物为衍生化试剂对待测药物中的双氢睾酮进行衍生化反应，得到含有双氢睾酮衍生化产物的样品；以所述含有双氢睾酮衍生化产物的样品配制供试品溶液，将所述供试品溶液用高效液相色谱进行检测，所述高效液相色谱的检测器为紫外检测器。该方案样品前处理过程中需要进行衍生化处理，操作较为复杂，所需样品体积大。

关于游离睾酮的测定的技术难点既在于提取后定量分析方法，还在于在前处理过程中将游离的睾酮和与结合蛋白的睾酮分离开再进行提取。有文献报道的游离化合物和蛋白结合的化合物的分离技术都是采用超滤法或是平衡透析法来达到分离得目的，然后再进行液液萃取来完成样品的制备，而最低定量下限为0.05ng/mL。

鉴于以上所述对游离睾酮微量提取、快速检测及检测精准和检测限更低的需求，需要一种所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、精密度强的游离睾酮检测方法。

发明内容

1、要解决的问题