[发明专利]一种检测游离睾酮的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：包含以下步骤：

步骤1：制备检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液：

将检测样品、标准曲线样品和质控样品加入缓冲液后超滤，分别得到超滤液后加入内标，分别于固相萃取柱中萃取，得到萃取液后吹干再复溶，得检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液；

步骤2：对检测样品上清液、标准曲线样品上清液和质控样品上清液进行高效液相色谱串联质谱分析，得检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液和内标的色谱峰面积；

步骤3：数据分析：

分析所述色谱峰面积，校正曲线以1/x²为加权系，用所述检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归；得游离睾酮含量。

2.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：所述高效液相色谱条件为：

进样器温度：15℃；柱温：40℃；运行时间：1.6min；洗脱梯度：

所述流动相A：水:乙腈体积比95:5的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

所述流动相B：水:乙腈体积比5:95的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵。

3.根据权利要求2所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：当5％的流动相B起始至1.2min时升至95％的流动相B进行梯度洗脱。

4.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：多反应监测参数表格：

扫描模式：多反应离子监测正离子模式；离子源：涡轮喷雾；电离模式：电喷雾离子化；雾化气：50psi；辅助加热器：50psi；气帘气：40psi；碰撞气：10；喷雾电压：5500V；离子源温度：550℃。

5.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：

所述标准曲线样品包括0.01、0.02、0.1、1、10、50、90、100ng/mL八个浓度梯度；

所述质控样品包括0.03、40、80ng/mL三个浓度梯度。

6.根据权利要求1所述的一种检测游离睾酮的方法，其特征在于：所述超滤条件中稳定剂为PBS缓冲液；所述萃取柱为HLB小柱；所述萃取条件为：淋洗，用10％的甲醇溶液淋洗两次；洗脱，用90％的甲醇溶液洗脱两次。

7.一种实现权利要求1-6任一项所述检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：

标准品溶液：睾酮储备液；

内标：Testosterone-d3溶液；

稳定剂；

替代基质；

洗脱液：甲醇；

流动相；

所述流动相中包含甲酸溶液和乙酸铵溶液。

8.根据权利要求7所述的一种检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：所述流动相包括流动相A和流动相B；

所述流动相A：水:乙腈体积比95:5的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

所述流动相B：水:乙腈体积比5:95的溶液，含体积分数0.1％甲酸和2mM乙酸铵。

9.根据权利要求7所述的一种检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液包括强洗脱液和弱洗脱液；所述强洗脱液为体积分数90％的甲醇溶液，所述弱洗脱液为体积分数10％的甲醇溶液。

10.根据权利要求7所述的一种检测游离睾酮的试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为PBS缓冲液，pH7.2；所述替代基质为4％BSA溶液。