[发明专利]一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法

说明书

本发明提供了一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了现有技术中HI蛋白纯化工艺在放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。它顺次包括下述步骤：（1）菌体破碎，（2）酶切，（3）澄清过滤，（4）SPFF柱层析，（5）SPHP柱层析，（6）Phenyl HP柱层析，（7）G25柱层析，（8）Q HP柱层析，（9）原液制备。本发明提供的重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，解决了HI蛋白纯化工艺在放大过程中纯化收率低的问题，蛋白收获量高。

技术领域

本发明涉及一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法。

背景技术

HI蛋白，金葡菌Hla是细菌pore-forming barrel毒素家族最主要的成员，分子量大小为30kD，是金葡菌感染的最主要的致病因子。Hla是一种外毒素，通常由致病性金葡菌特别是MRSA产生。其可通过促使中性粒细胞裂解，以及对上皮细胞的损害而发挥生物学效应，引起菌血症等临床症状。Hla缺失的突变株在侵入性感染动物实验中毒力减弱，致病作用减小。Wardenburg等构建了无毒的缺乏裂解细胞活性的突变体Hla(H35L)，免疫小鼠后诱导产生了高效价的保护性抗体，能够有效中和Hla，从而降低了金葡菌感染后的致死率。表明无裂解特性的无毒Hla突变体可以作为金葡菌疫苗的候选抗原分子。

但是，现有技术中的HI蛋白纯化工艺是将破菌液直接经过亲和层析(Glutathione4 FF)进行融合蛋白的捕获和酶切，以达到初步纯化目的蛋白的目的，该工艺放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少(HI抗原蛋白的收率为0.3mg蛋白/g菌左右)的情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，以解决现有技术中HI蛋白纯化工艺在放大过程中出现纯化收率低，蛋白收获量少的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法，顺次包括下述步骤：

(1)菌体破碎

将HI菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；

(2)酶切

应用PP酶溶液对步骤(1)中的收集的上清液进行酶切；

(3)澄清过滤

将步骤(2)酶切后的菌液调节pH至6.4-6.6，然后将上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；

(4)SPFF柱层析

采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤(3)收集的过滤液进行初纯，得到HI蛋白SPFF洗脱液；

(5)SPHP柱层析

采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤(4)得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；

(6)Phenyl HP柱层析

采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤(5)得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，得到HI蛋白phenyl HP洗脱液；

(7)G25柱层析

采用G25层析柱对步骤(6)得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；

(8)Q HP柱层析

采用Q HP层析柱对步骤(7)得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；