[发明专利]一种重组金黄色葡萄球菌疫苗HI抗原蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种重组金黄色葡萄球菌疫苗 HI抗原蛋白的纯化方法，其特征在于：顺次包括下述步骤：

（1）菌体破碎

将HI菌体用缓冲液溶解，然后破菌、离心，收集上清液；

（2）酶切

应用PP酶溶液对步骤（1）中的收集的上清液进行酶切；

（3）澄清过滤

将步骤（2）酶切后的菌液调节pH至6.4-6.6，然后将上清使用Cobetter 0.6～0.8μm或Pall PDH4深层滤板进行澄清过滤，收集过滤液；

（4）SPFF柱层析

采用GE SPFF填料装填层析柱，对步骤（3）收集的过滤液进行初纯，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、中间清洗、洗脱以及收集标准分别为：

层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；

缓冲液： SPFF平衡液：20mM PB，pH为 6.0；SPFF洗脱液：20mM PB+1M NaCl，pH为 6.0；

上样流速：36-72L/h，RT=5-10min；

复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：36-72L/h，平衡体积：5～8CV，至UV值、电导平稳；

中间清洗：清洗流速36-72L/h，洗脱梯度6%B，清洗2CV；

洗脱：洗脱流速36-72L/h，洗脱梯度15%B；

收集标准：收集HI蛋白SPFF洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU时停止收集，记录收集的HI蛋白SPFF洗脱液体积；得到HI蛋白SPFF洗脱液；

（5）SPHP柱层析

采用GE SPHP填料装填层析柱，对步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液进行中度纯化，具体包括下述步骤：

①使用pH 为6.0的20mM PB将步骤（4）得到的HI蛋白SPFF洗脱液稀释2-5倍，控制电导率≤6.0 ms/cm，搅拌4-6min混合均匀，关闭搅拌；在2～8℃保温，静置状态下放置4～20h，然后将稀释液上清采用Cobetter 0.22μm滤膜进行减菌过滤，待上柱纯化；

②采用GE SPHP填料装填层析柱，对HI蛋白SPFF洗脱样品稀释液进行中度纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：

层析柱：柱高18-20cm、柱直径200mm、柱体积5.5-6.5L；

缓冲液： SPHP平衡液：20mM PB，pH为6.0；SPHP洗脱液：20mM PB+1M NaCl，pH为6.0；

上样流速：12-24L/h，RT=15-30min；

复平衡：使用平衡缓冲液复平衡层析柱，流速12-24L/h；平衡体积：2～5CV，至UV值、电导平稳；

洗脱：洗脱流速12-24L/h，洗脱梯度0～50%B，10CV；

收集标准：收集HI蛋白SPHP层析洗脱液，当UV280nm≥500mAU时开始收集峰，当UV280nm≤500mAU停止收集，记录收集的HI蛋白SPHP层析洗脱液体积；得到HI蛋白SPHP层析洗脱液；

（6）Phenyl HP柱层析

采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对步骤（5）得到的HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，具体包括下述步骤：

①按照体积比HI蛋白SPHP层析洗脱液：硫酸铵溶液=10-12：4，加入20mM PB+3M（NH₄）₂SO₄(pH6.0)进行稀释，待进行下一步纯化；

②采用GE phenyl HP填料装填层析柱，对HI蛋白SPHP层析洗脱液进行精细纯化，采用的层析柱、缓冲液、上样流速、复平衡、洗脱以及收集标准分别为：

层析柱：柱高为9-11cm，柱直径140mm、柱体积1.2-1.8L；

缓冲液： Phenyl HP平衡液：20mM PB+0.8M（NH₄）₂SO₄，pH为6.0；Phenyl HP洗脱液：20mMPB，pH为6.0；

上样流速：12-24L/h，RT=3.75-7.5min；

复平衡：使用平衡缓冲液再次平衡柱子，平衡流速：12-24L/h，平衡体积：3-5CV，至UV值、pH、电导稳定；

洗脱：洗脱流速：12-24L/h，洗脱梯度：0-100%B，10CV；

收集标准：收集HI蛋白phenyl HP洗脱液，当UV280nm值到达峰顶端且开始下降时开始收集，当UV280nm≤200mAU停止收集，记录收集的HI蛋白phenyl HP洗脱液体积；得到HI蛋白phenyl HP洗脱液；

（7）G25柱层析

采用G25层析柱对步骤（6）得到的HI蛋白phenyl HP洗脱液进行脱盐换液，得到HI蛋白G25层析液；

（8）Q HP柱层析

采用Q HP层析柱对步骤（7）得到的HI蛋白G25层析液进行层析，得到HI蛋白Q HP流穿液；

（9）原液制备

将步骤（8）得到的HI蛋白Q HP流穿液进行除菌过滤，得到HI蛋白原液。