[发明专利]一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断目的的检测，包括以下步骤：

S1，提供DNA模板以及突变型锁式探针，通过连接酶连接，获得环化产物；所述的突变型锁式探针的序列为5’连接臂-第一功能区-第二功能区-第三功能区-3’连接臂，所述的5’连接臂和3’连接臂与DNA模板互补，且DNA点突变位点设计在锁式探针的3’末端；

S2，加入滚环引物，与S1中所述的环化产物结合，进行滚环扩增，获得带有茎环结构的长串联重复序列片段；所述的滚环引物的5’-3’端的序列依次为：第一功能区，以及与第二功能区反向互补序列；

S3，加入茎环引物，与所述的带有茎环结构的长串联重复序列片段结合，延伸得到双茎环结构产物；所述的茎环引物包含3’突出端，且3’突出端的序列与所述的第三功能区相同；

S4，利用环介导等温扩增技术扩增所述的双茎环结构产物，并进行检测分析；

其中，所述的突变型锁式探针的5’连接臂长度为10-20 bp，3’连接臂长度为15-25 bp，第一功能区长度为10-20 bp，第二功能区长度为15-30 bp，第三功能区长度为20-40 bp；所述的第一功能区、第二功能区、第三功能区三部分不要和模板DNA序列有大量非特异性结合片段。

2.如权利要求1所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述的方法还包括对所述DNA模板的质量进行检测，具体包括：提供正常型锁式探针，用于替换所述的突变型锁式探针，并依次进行步骤S1、S2、S3、S4；所述的正常型锁式探针的序列为5’连接臂-所述的第一功能区-所述的第二功能区-所述的第三功能区-3’连接臂，其中，所述的正常型锁式探针的5’连接臂和3’连接臂设计在DNA模板的非突变位点区。

3.如权利要求2所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述的正常型锁式探针的5’连接臂长度为10-20 bp，3’连接臂长度为15-25 bp，第一功能区长度为10-20 bp，第二功能区长度为15-30 bp，第三功能区长度为20-40bp。

4.如权利要求1所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述的S1反应条件为：65°C 、10min或95°C、5min预加热，95°C、30s到65°C，5 min 共10个循环，再95°C、 5 min。

5.如权利要求1所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于， 步骤S4采用荧光染色法进行检测分析。

6.一种采用权利要求2或3所述方法检测突变的试剂盒，其特征在于，包含：所述的突变型锁式探针、所述的正常型锁式探针、所述的滚环引物、所述的茎环引物，所述的试剂盒还包含等温扩增引物，所述的等温扩增引物和所述的滚环引物一起用于扩增所述的双茎环结构产物。

7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的正常型锁式探针、突变型锁式探针的使用浓度为1 nM- 100 nM。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的滚环引物的使用浓度为0.5 μM-1.5 μM，茎环引物的使用浓度为50 nM- 150 nM，等温扩增引物的使用浓度为0.5μM- 1.5 μM。

9.如权利要求6所述的检测突变的试剂盒，其特征在于，所述的突变为肺炎支原体A2063G点突变，所述的突变型锁式探针序列为：5’-ccgtcccgttgcgcctaacttttcgacacgacacgatttt ggaactctgctcgacggattaaaataatacagtctgcccacaaccttttaagcttcacggggtcttc-3’；

所述的正常型锁式探针序列为：5’-ccca tatacatcaccttacgttttcgacacgacacgattttggaactctgctcgacggattaaaataatacagtctgcccacaaccttttcagcactggg caggtgtcac-3’。