[发明专利]一种人脐带组织冷冻储存方法

权利要求书

1.一种人脐带组织冷冻储存方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1: 人脐带组织样本运送；

将新鲜人脐带组织样本在无菌条件下转移至无菌收集瓶内并密封，不添加任何试剂，在冷藏条件下进行运送，冷藏运送温度2～6℃，本操作时间控制在24小时以内；采用无保存液的干式运送方法，直接将组织放置于无菌收集瓶并密封运送；

S2：人脐带组织样本前处理；

（1）将脐带组织样本运送到处理机构并经过交接确认后，将脐带传入洁净区，传入生物安全柜中；

（2）打开所述收集瓶，加入含双抗的DPBS溶液，使之没过脐带组织，4℃条件下浸泡60min；

（3）打开组织收集瓶，将脐带组织取出，置于100mm或150mm的培养皿中，剪切成5cm的脐带组织段；

（4）将步骤（3）中处理的脐带组织，清洗消毒，去除血水；清洗消毒溶液为DPBS及过滤除菌后的75%医用酒精；清洗消毒次数为3次，顺序为DPBS、75％医用酒精，DPBS；各清洗消毒溶液体积为10mL；

（5）将步骤（4）中的脐带组织置于另一个100mm或150mm培养皿中，使用组织剪沿横截面纵向剪开；

（6）进一步将步骤（5）中脐带剪碎成0.25cm²的组织块，剪碎过程中用3～7mL DPBS以保持组织湿润；

（7）将组织块分组放入到2mL冻存管中，每组包含4-5块人脐带组织块，加入0.8～1.2mL/管、含8～15%DMSO的无血清冻存液；

（8）4℃预冷30～60min；

其中，所述DPBS溶液为含1%～3%双抗的DPBS；

S3：人脐带组织样本缓慢降温程序：

（1）启动程序降温仪控制系统，设定缓慢降温程序；

（2）启动程序降温仪预冷程序，使程序降温仪腔体温度达到起始降温温度；

（3）将预冷的组织样本，快速转移至程序降温仪内的2mL冻存管管架内；

（4）启动程序降温程序；所述缓慢降温程序如下：

第一阶段，温度控制在4℃保持5min；

第二阶段，将温度从4℃降至-8℃，降温速率2℃/min，降温时间6min；

第三阶段，维持温度为-8℃保持10 min；

第四阶段，将温度从-8℃降至-40℃，降温速率0.3℃/min；

第五阶段，将温度从-40℃降至-150℃，降温速率30℃/min，降温时间3min40s；

第六阶段，维持温度为-150℃保持10min；

（5）程序降温结束后，迅速将冻存管移入深低温冷冻储存器内长期储存；所述深低温冷冻储存器为-150℃以下的气相液氮存储罐。