[发明专利]一种柑橘原生质体的制备方法

说明书

本发明提出了一种柑橘原生质体的制备方法，该方法以下步骤：外植体热激处理、原生质体的酶解、原生质体的纯化。本发明的优点是采用热处理和酶解法分离出高质量的柑橘原生质体，该方法制备得到的原生质体产量高，活性好，其产量在5×10⁶个/克鲜重以上，活力超过80％。

技术领域

本发明涉及一种柑橘原生质体的制备方法，属于生物原生质体制备技术领域。

背景技术

原生质体是指去掉细胞壁的裸露活细胞。原生质体不仅是探索生命理论研究的良好体系，还可以通过对其进行各种细胞操作及遗传操作，从而改良作物某些性状，在生产和应用上具有巨大潜力。迄今，原生质体技术已成功用于体细胞杂交、遗传转化、基因瞬时表达、蛋白质互作、信号转导、基因编辑和单细胞测序等方面。例如，华中农业大学通过柑橘原生质体融合技术培育出雄性不育和果实无核的胞质杂种新品种“华柚2号”，该品种已获农业部植物新品种权（品种权号CNA20101034.2）。然而，该技术应用的前提条件是分离获得高产量和高活力的原生质体。

目前影响原生质体分离的因素主要有基因型、外植体时期、预处理、酶液组合和浓度、酶解时间、渗透压等。其中，酶液组合和预处理是影响原生质体分离成败的关键因素。近年来，柑橘生物技术发展迅速，其中以原生质体为研究对象的体细胞杂交和遗传转化取得了较大进展。柑橘原生质体主要由愈伤组织和叶片分离而来，但其产量和活力不稳定。有必要进一步优化柑橘原生质体的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种柑橘原生质体的制备方法，该方法简单高效，所制备的原生质体产量高、活性好。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种柑橘原生质体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、外植体热激处理—将柑橘外植体置于恒温培养箱进行热处理；

步骤二、原生质体的酶解—取步骤一的柑橘外植体，加入酶液进行酶解；

步骤三、原生质体的纯化—将酶解后的液体过滤去除渣质后，洗涤、离心去上清，沉淀用CPW25悬浮，向悬浮液加入CPW13，离心，使原生质体位于两层液体之间，用吸管吸取原生质体。

在柑橘原生质体分离过程中，多个热激转录因子和热激蛋白基因显著上调表达，因此说明这些基因对原生质体分离及再生具有重要作用。本发明在原生质体分离前对材料进行热激处理，可显著上调这些基因的表达，以提高原生质体的产量和活性。

本发明进一步优化的技术方案如下：

所述步骤一中，热处理的温度为36～45℃，时间为1～6小时。

所述步骤二中，取柑橘外植体1～2克，加入2～3毫升酶液，在黑暗条件下酶解，酶解温度为28℃，时间为16～20小时。

所述步骤二中，酶液组成如下：MT培养基+ 质量百分比1.5-3％ 的纤维素酶+ 质量百分比1.5-3％的果胶酶+ 质量百分比0.0055％的NaH₂PO₄.2H₂O + 质量百分比0.06％的2-吗啉乙磺酸 +质量百分比0.18％的CaCl₂.2H₂O +0.6-0.7M的甘露醇 + 250mg/L麦芽提取物。

所述步骤三中，沉淀用2-4ml CPW25 悬浮，在其上轻轻加入1-2ml CPW13 ，然后在100转条件下离心2-6 分钟。

本发明的方法还包括步骤四、原生质体的重悬—将纯化的原生质体重悬于原生质体液体培养基中进行培养。

所述步骤四中，原生质体液体培养基配方如下：MT基础培养基 + 0.7M甘露醇 +40mg/L腺嘌呤；pH 5.6。