[发明专利]一种柑橘原生质体的制备方法在审
| 申请号： | 202110312495.1 | 申请日： | 2021-03-24 |
| 公开（公告）号： | CN112760276A | 公开（公告）日： | 2021-05-07 |
| 发明（设计）人： | 徐小勇;张亦武;陆春毅;缪星辰;顾铭洲 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04 |
| 代理公司： | 南京苏科专利代理有限责任公司 32102 | 代理人： | 杜春秋 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 柑橘 原生 质体 制备 方法 | ||
1.一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、外植体热激处理—将柑橘外植体置于恒温培养箱进行热处理；
步骤二、原生质体的酶解—取步骤一的柑橘外植体，加入酶液进行酶解；
步骤三、原生质体的纯化—将酶解后的液体过滤去除渣质后，洗涤、离心去上清，沉淀用CPW25悬浮，向悬浮液加入CPW13，离心，使原生质体位于两层液体之间，用吸管吸取原生质体。
2.根据权利要求1所述一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，热处理的温度为36～45℃，时间为1～6小时。
3.根据权利要求1所述一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，取柑橘外植体1～2克，加入2～3毫升酶液，在黑暗条件下酶解，酶解温度为28℃，时间为16～20小时。
4.根据权利要求3所述一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，酶液组成如下：MT培养基+ 质量百分比1.5-3％ 的纤维素酶+ 质量百分比1.5-3％的果胶酶+质量百分比0.0055％的NaH2PO4.2H2O + 质量百分比0.06％ 的2-吗啉乙磺酸 +质量百分比0.18％的CaCl2.2H2O +0.6-0.7M的甘露醇 + 250mg/L麦芽提取物。
5.根据权利要求1所述一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，沉淀用2-4ml CPW25 悬浮，在其上轻轻加入1-2ml CPW13 ，然后在100转条件下离心2-6 分钟。
6.根据权利要求1所述一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于：还包括步骤四、原生质体的重悬—将纯化的原生质体重悬于原生质体液体培养基中。
7.根据权利要求6所述一种柑橘原生质体的制备方法，其特征在于：所述步骤四中，原生质体液体培养基配方如下：MT基础培养基 + 0.7M甘露醇 + 40mg/L腺嘌呤；pH 5.6。
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