[发明专利]一种测定MSC组织分布的方法

说明书

本发明提供了一种测定MSC组织分布的方法：（1）将人间充质干细胞输注实验鼠体内，每隔一定时间对需监测器官或组织取样并提取DNA样品；（2）以确定数量的人间充质干细胞提取DNA并稀释成系列浓度的DNA溶液；（3）以如SEQ ID NO:1和2所示序列为引物，以步骤（1）中的DNA样品和步骤（2）中的DNA溶液为模板进行实时荧光定量PCR；（4）步骤（2）中系列浓度的DNA溶液的CT值制作标准曲线，计算步骤（1）中DNA样品的数量。本发明对组织中间充质干细胞的绝对定量，可以检测间充质干细胞在各个组织中的定植率和体内各个组织中随时间的代谢情况，为临床方案中给药途径和剂量的设计提供了参考依据。

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种定量测定MSC组织分布的方法。

背景技术

间充质干细胞是一种来源于中胚层的多能性干细胞，具有良好的自我更新以及多向分化能力。因其来源范围广，具备多向分化潜能以及强大的归巢能力，使其在临床治疗中得到了很好的应用。干细胞作为药物申报，需要依赖于动物进行临床前研究，尤其是药物水平有效性和药物代谢水平的研究。目前运用同位素示踪、小动物活体成像、普通PCR等技术已经可以实现细胞的在体或离体示踪，然而这些示踪也仅仅是停留在对细胞的定性以及相对定量层面，无法实现对组织中细胞含量进行精确定量。

发明内容

针对现有技术中无法精确定量组织中间充质干细胞数量的问题，本发明提供一种定量测定MSC组织分布的方法，采用实时荧光定量PCR。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种测定MSC组织分布的方法，包括以下步骤：

（1）将人间充质干细胞输注实验鼠体内，每隔一定时间对需监测器官或组织取样并提取DNA样品；

（2）以确定数量的人间充质干细胞提取DNA并稀释成系列浓度的DNA溶液；

（3）以如序列SEQ ID NO:1和2所示的序列为引物，以步骤（1）中的DNA样品和步骤（2）中的DNA溶液为模板进行实时荧光定量PCR；

（4）步骤（2）中系列浓度的DNA溶液的CT值制作标准曲线，计算步骤（1）中DNA样品的数量。

所述实验鼠选自小鼠、大鼠或裸鼠。

所述人间充质干细胞的来源不限，优选为胎盘、脐带、骨髓、脂肪或血液。

优选的，所述人间充质干细胞的流式细胞检测为CD73、CD105、CD44、CD90阳性率均在98%以上，CD34、CD45、HLA-DR检测阴性率在0.2%以下。

所述实时荧光定量PCR以SYBR Green为荧光染料。

本发明具有以下优点：

本发明的以人鼠基因差异性为基础，选择间充质干细胞特异的表面标记物基因CD105为扩增的目的基因。从CD105基因中选择小鼠缺失严重而人序列保持完整的CD105片段上进行引物设计，用作实时荧光定量PCR扩增的引物，特异性高、检测限低。

本发明的方法运用实时荧光定量PCR技术代替了普通的PCR技术，通过人鼠基因差异性设计人源基因特异性引物进行实时荧光定量PCR，实现了对组织中间充质干细胞定植率的绝对定量。设计的引物特异性高，对人间充质干细胞的定量更加精确。本发明对组织中间充质干细胞的绝对定量，可以追踪细胞在体内各个组织中随时间的代谢情况和在各个组织中的定植率，为干细胞药物开发中的药代动力学研究提供了方法学支持，为临床方案中给药途径和剂量的设计提供了参考依据。

附图说明

图1为间充质干细胞的培养与表型鉴定结果；

图2为各引物对获得的溶解曲线；

图3为各引物对获得的标准曲线；

图4为引物对1的特异性验的溶解曲线；

图5为不同组织中间充质干细胞含量。