[发明专利]血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株rR188I及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 202110308742.0 | 申请日： | 2021-03-23 |
| 公开（公告）号： | CN113151193B | 公开（公告）日： | 2023-08-01 |
| 发明（设计）人： | 潘青;王笑梅;高玉龙;祁小乐;刘长军;崔红玉;刘爱晶;张艳萍;李凯;高立 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12N15/63;C12N15/66;A61K39/235;A61P31/20 |
| 代理公司： | 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 | 代理人： | 马鑫 |
| 地址： | 150040 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 血清 型禽腺 病毒 反向 遗传 疫苗 rr188i 及其 构建 方法 应用 | ||
1.血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通过将我国FAdV-4新近分离株HLJFAd15的Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变为I，然后通过病毒拯救后获得的；所述的FAdV-4新近分离株HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797.1。
2.如权利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株，其特征在于，所述的血清4型禽腺病毒反向遗传疫苗株是通过以下方法构建得到的：
(1)含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒的构建
获得FAdV-4新近分离株HLJFAd15毒株的全基因序列，HLJFAd15的全基因组GenBank序列号为KU991797，连接至pCC1Fos载体，经噬菌体包装后电转进EPI300感受态细胞中，涂布在氯霉素抗性LB平板上，挑取阳性克隆，经ZR BAC DNA miniprep Kit提取粘粒后，使用载体通用引物测序，得到含有HLJFAd15毒株完整基因组的粘粒，命名为Fos-rFAdV4；
(2)rR188I感染性克隆粘粒的构建
将HLJFAd15的Hexon基因克隆至pCAGGS载体中，所用引物为pCAGGS-Hexon F/R，然后将Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即编码的第188位氨基酸由R突变为I，所用引物为pR188I F/R，生成突变质粒pCAGGS-Hexon-R188I；接着使用Counter-Selection BACModification Kit构建rR188I感染性克隆粘粒，方法如下：首先将步骤(1)构建的Fos-rFAdV4电转进DH10B感受态细胞中，通过氯霉素抗生素筛选阳性克隆；然后再将Counter-Selection BAC Modification Kit试剂盒中的重组酶质粒pRed E/T电转进含Fos-rFAdV4的DH10B感受态细胞中，通过氯霉素和链霉素筛选阳性克隆；以Counter-Selection BACModification Kit试剂盒中的rpsl-neo表达盒DNA为模板，使用引物R188I-rpslneo F和R188I-rpslneo R扩增带有需替换Hexon基因片段两端各50bp同源臂的rpsl-neo表达盒，将回收的PCR产物直接转化进入经L-阿拉伯糖诱导的含有Fos-rFAdV4和pRed E/T的DH10B感受态细胞中，即可替换原始Hexon基因，通过氯霉素、链霉素和卡那霉素抗生素筛选阳性克隆，得到Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo；再以相同方式，以pCAGGS-hexon-R188I质粒为模板，所述的pCAGGS-hexon-R188I质粒为HLJFAd15毒株Hexon基因克隆到pCAGGS中得到，使用引物R188I F和R188I R扩增突变的Hexon基因，将PCR产物电转进上一步阳性克隆制备的经L-阿拉伯糖诱导的含Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo的DH10B感受态中，通过链霉素和氯霉素抗生素筛选得到Hexon基因的第563位碱基由G突变为A，即第188位氨基酸由R突变为I的阳性克隆，命名为Fos-rR188I；引物序列如下：
pCAGGS-Hexon F：
pCAGGS-Hexon R：
pR188I F：CAGGGACCCGGAAtAAATCCTCTGCGA
pR188I R：TCGCAGAGGATTTaTTCCGGGTCCCTG
R188I-rpslneo F：
R188I-rpslneo R：
R188I F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCC
R188I R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATG
(3)病毒拯救
用QIAGEN质粒中提试剂盒提取Fos-rR188I粘粒，用FseI限制性内切酶进行线性化，通过醇沉回收DNA，将LMH细胞接种至6孔板，用转染试剂X-tremeGene HP DNA TransfectionReagent Kit转染线性化的Fos-rR188I，转染后6h更换新鲜培养基，5d后将6孔板放入-80℃冰箱反复冻融3次，离心，收集上清，即为拯救所获的rR188I重组毒。
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