[发明专利]一种用于氟啶虫酰胺农药速测的试纸条及其制备方法及检测方法

权利要求书

1.一种氟啶虫酰胺农药速测的试纸条，该试纸条是基于间接竞争免疫层析法金标速测试纸条，包括条形的PVC衬板，PVC衬板上沿长度方向从左至右依次设置有吸水垫、硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫和样品垫，其特征在于：其中金标抗体结合垫上包被有胶体金标记的农药特异性兔多抗，硝酸纤维素膜上包被有农药小分子完全抗原的检测线和羊抗兔IgG二抗质控线。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜粘贴在PVC衬板的中间位置，金标抗体结合垫的左半部分粘贴在硝酸纤维素膜的右端上方，样品垫粘贴在金标抗体结合垫的右半部分上方，样品垫的右端与PVC衬板的右端齐平，吸水垫的左端与PVC衬板的左端齐平，吸水垫的右端粘贴在硝酸纤维素膜的上方，且盖住2.5～3.5mm。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的农药特异性兔多抗是由30±1nm的纳米金颗粒与农药特异性兔多抗相结合的复合物，农药特异性兔多抗与胶体金的结合浓度为60±1mg/L，即每1L的胶体金溶液中配用60±1mg的农药特异性兔多抗，胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0.01±0.001％。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述检测线包被的农药小分子完全抗原是指分别将农药半抗原偶联到鸡卵清蛋白(OVA)上的人工抗原，浓度为500±5mg/L；农药半抗原与OVA的偶联比为20±1：1；羊抗兔1gG二抗质控线浓度为800±5mg/L，检测线和质控线的包被量均为0.6±0.1μL/mm²。

5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品垫采用奥斯龙8964玻璃纤维纸，样品垫需作封闭液处理，封闭模式为样品垫完全吸收封闭液，再作干燥处理。

6.一种根据权利要求1～5任一权利要求所述的试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、抗原、包被原与多克隆抗体的制备

1)完全抗原的制备：称取4.5±0.1mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用200±5uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7±0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0±0.1mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6±1h(称为TFNA半抗原活化液)；将牛血清白蛋白10±1mg，用3±0.1ml硼酸缓冲溶液溶解(称为蛋白A液)，在室温条件，将TFNA半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原；

2)包被原的制备：称取7.8±0.1mg氟啶虫酰胺代谢物(TFNA)半抗原，用300±5uL无水N，N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5±0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9±0.1mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6±1h(称为TFNA半抗原活化液)；称取10±1mg鸡卵白蛋白OVA，溶解于2±0.1ml硼酸缓冲溶液中(称为B液)，在室温条件下，将TFNA半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原；

3)多克隆抗体的制备：实验动物选择雄性新西兰大白兔，首免前7天，对试验动物的耳缘静脉取血，分离阴性血清；首次免疫将免疫原(2mg/mL)与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/mL)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价；最后一次免疫，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清，经亲和层析纯化多克隆抗体；

二、试纸条制备

A、胶体金的制备

用新制去离子水配制一定体积的0.01±0.001％(质量浓度)氯金酸溶液，采用冷凝管回流、油浴锅等加热方式将氯金酸溶液加热至沸腾；在磁力搅拌的同时，迅速加入一定体积的1±0.1％(质量浓度)柠檬酸钠水溶液，氯金酸溶液与柠檬酸钠水溶液的体积用量比为100:(0.75～2)，观察溶液颜色变化；当溶液的颜色完全时，继续回流5-7min后停止加热，制备得到胶体金溶液；该胶体金溶液内金胶体的颗粒平均直径为20～60nm金胶体，冷却后无菌密封4℃下保存；

B、金标抗体的制备

取10±0.1mL质量浓度为0.01％的胶体金溶液，逐滴加入1±0.1mL 60mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物特异性兔多抗(一抗)溶液，边加边混匀，混合均匀后静置1±0.1h；再加入2.5±0.1ml含5％BSA(牛血清蛋白)和0.1％PEG(聚乙二醇)的20mM硼酸缓冲溶液，混合均匀后静置1±0.1h；4℃条件下10000±100r/min离心30±1min，弃上清，红色沉淀再用10±0.1mL含1％BSA和0.02％PEG的20±1mM硼酸缓冲溶液复溶(洗涤作用)，然后4℃条件下10000±100r/min离心30±1min，弃上清，再重复上述复溶离心弃上清一次；最后用1％BSA和5％蔗糖的20mM硼酸缓冲溶液溶解红色沉淀并定容至1ml，即获得纯化的氟啶虫酰胺及其代谢物金标一抗，放置于4℃冰箱中备用；

C、样品垫处理

配制封闭液，称取60±1mg牛血清白蛋白(BSA)、60±1mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1000±10mg蔗糖，加入20±1mL 0.01M含0.05％吐温的磷酸缓冲溶液(PBST)中；

将上述试剂和溶液充分涡旋混匀，直至完全溶解，即完成封闭液配制；将样品垫浸入封闭液中，待完全吸附封闭液(即封闭液的余量不再改变，一般为20-30s)后取出，并在37±1℃烘箱中干燥3±0.5小时；放入封口袋，并保存于玻璃干燥器中；

G、金标抗体结合垫制备

将步骤B中所得农药特异性金标抗体均匀包被在步骤C中已干燥的样品垫上，包被量为0.6±0.01μL/mm²，37±1℃烘箱中干燥30±1min，得金标抗体结合垫；放入封口袋中并保存于玻璃干燥器中；

H、检测线、质控线的包被

首先配制保护剂，保护剂为含1±0.1％蔗糖的0.01M PBS溶液；再以配制好的保护剂作为稀释液，分别配制500mg/L的氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA偶联物(检测线)和800mg/L的羊抗兔IgG(质控线)；

采用自动划线仪划线，将检测线和控制线包被在硝酸纤维素膜上，检测线和控制线的包被量均为0.6±0.01μL/mm²；划线完成后将硝酸纤维素膜放于37±1℃烘箱中干燥10±1min，得到包被氟啶虫酰胺及其代谢物半抗原-OVA的检测线和包被羊抗兔IgG二抗质控线硝酸纤维素膜；

I、试纸条的组装

先在PVC衬板的中间段贴上步骤E中制备好的包被有检测线和控制线的硝酸纤维素膜，然后在该硝酸纤维素膜上粘贴金标抗体结合垫，粘贴位置使约一半的金标抗体结合垫位于硝酸纤维素膜的上方；然后，将封闭液处理过的样品垫粘贴在金标抗体结合垫的上方，粘贴位置盖住约一半的金标抗体结合垫；最后粘贴吸水垫，粘贴位置为盖住硝酸纤维素膜约3±0.5mm；衬板组装完成后水平放入自动切条机中，将其切割成3-4mm宽的试纸条。