[发明专利]一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法

权利要求书

1.一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1将凝结芽孢杆菌在选择性培养基中进行划线活化，得到单菌落；

S2将S1中的单菌落经活化培养后转接到种子培养基中进行扩大培养，得到发酵种子液；

S3将S2中的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分段式分批补料发酵。

2.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S1中，选择性培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖0.5～3％、蛋白胨0.5～2％、酵母粉0.1～1％、牛肉浸取物0.5～2％、三水合乙酸钠0.1～1％、三水合磷酸氢二钾0.1～1％、一水合硫酸锰0.01～0.1％、七水合硫酸镁0.005～0.01％、碳酸钙0.1～0.5％和柠檬酸钠0.05～0.5％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5～7.5之间，再加入琼脂粉1.5～2％，121℃灭菌20min制备得到。

3.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S2中，种子培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，蔗糖1～3％、酵母粉0.5～1.5％、蛋白粉1～3％、磷酸氢二钾0.3～1％和氯化钠0.5～1.5％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至6.5～7.5之间，121℃灭菌30min制备得到。

4.根据权利要求3所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，蛋白粉的制备方法为，羽毛粉经酶解后喷雾干燥处理，再与蛋白胨混合得到；羽毛粉的酶解工艺为，按每克羽毛粉添加10～20单位的中性角蛋白酶，在pH6.0～7.0条件下处理48h，再按每克羽毛粉添加20～30单位碱性角蛋白酶在pH8.0～9.0条件下处理48h即可。

5.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S3中，发酵培养基的组成成分如下：按质量百分比计算，发酵豆粕2～5％、蔗糖1～3％、蛋白粉1～3％、磷酸氢二钾0.1～05％、七水合硫酸镁0.01～0.05％、一水合硫酸锰0.01～0.05％、碳酸钙0.5～1.5％和氯化钠0.5～2％，余量为水；以氢氧化钠和盐酸调节pH至5.0～7.0之间，121℃灭菌30min制备得到。

6.根据权利要求5所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，发酵豆粕的制备方法为，生豆粕经混合菌包发酵后烘干粉碎得到；混合菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、或乳酸菌中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，S3中，分段式分批补料发酵包括三个发酵阶段，第一个阶段为菌体快速生长阶段，第二阶段为补料阶段，第三阶段为芽孢形成阶段。

8.根据权利要求7所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，第一阶段的发酵罐控制条件如下：接种量3～10％，培养温度40～50℃，pH控制为5.5～6.5，通气量0.5～1.0m³/h，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，搅拌转速100～150r/min，该阶段持续培养时间为12～18h。

9.根据权利要求7或8所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，第二阶段的补料培养基组成成分如下：按质量百分比计算，葡萄糖0.5～2％、蛋白粉0.5～2％和酵母粉0.5～1％，余量为水，121℃灭菌20min制备得到；第二阶段的补料时间为发酵液的pH开始由下降转变为上升时开始补料，补料周期为12～24h。

10.根据权利要求7所述的高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法，其特征在于，第三阶段的发酵罐控制条件如下：培养温度35～45℃，pH控制为7.0～8.0，通气量1.0～1.5m³/h，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，搅拌转速200～300r/min，溶氧维持10％～30％，该阶段持续培养时间为12～24h。