[发明专利]一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基

说明书

为克服现有利普斯他汀发酵方法中发酵单位偏低、发酵原料成本高、工艺复杂难控、不适用于大规模工业化生产等问题，本发明提供了一种简便高效的利普斯他汀发酵方法与发酵培养基，包括以下步骤：平皿分离与斜面培养、菌种斜面摇瓶发酵筛选、摇瓶种子液制备、一级种子罐培养、二级种子罐培养和发酵罐培养。本发明通过摇瓶发酵筛选高产菌株、各级培养基优化以及发酵过程工艺改进等组合优化策略获得的利普斯他汀发酵方法与发酵培养基，具有发酵单位高、发酵原料成本低、发酵过程控制简单方便、无需添加外源毒性前体等优势，对于提高利普斯他汀发酵产量和产品质量、降低生产成本均具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基。

背景技术

利普斯他汀是由毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)产生的一种具有良好的抑制脂肪酶活性的天然产物，其氢化衍生物奥利司他是目前全球最畅销的减肥药物。奥利司他作为一种胃肠道脂肪酶抑制剂，通过与胃和小肠腔内的脂肪酶活性丝氨酸部位形成共价键结合，使脂肪酶失活从而不能将食物中的脂肪分解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油，从而减少热量摄入，控制体重增加，达到控制体重、降糖、降压、调脂等目的。奥利司他是唯一通过美国FDA、欧洲EMA、中国NMPA同时批准治疗肥胖症的非处方药物，亦是目前唯一经NMPA批准在中国销售和使用的减肥药。

目前奥利司他的生产工艺技术路线有发酵半合成法和化学全合成法两种，化学全合成路线合成步骤长、反应操作较繁、反应条件苛刻、分离提纯收率低且对环境污染较大，不符合绿色化工低碳经济的发展趋势。目前工业上主要通过发酵半合成技术制备奥利司他，首先通过毒三素链霉菌发酵获得富含利普斯他汀的发酵液，然后经过分离纯化获得利普斯他汀，再经过一步加压氢化即可高效地得到目标成分奥利司他。虽然发酵半合成的奥利司他需要经过发酵、分离纯化、合成等几个环节，技术路线和过程参数控制比较复杂，但与化学全合成法相比，更加绿色环保、更加符合清洁生产要求。

自奥利司他作为一种减肥药物进入临床以来，以提高利普斯他汀发酵单位的生物合成机制解析、菌种遗传选育、发酵培养基筛选和发酵过程工艺优化工作一直属于生物发酵领域的研发热点，至今热度不退，发表了数量众多的论文。国内外有不少有关利普司他汀发酵生产的专利报道。美国专利US4598089,US2005089978A1采用了无补料分批发酵工艺，发酵单位最高只有1.7～1.8g/L。国际专利W02007134836A1和欧洲专利EP0803576采用了发酵过程中添加亚油酸、辛酸和亮氨酸等前体以促进利普斯他汀合成的补料分批发酵工艺，发酵单位最高3.0～3.2g/L。美国专利US20110014664A1采用了同时流加亚油酸和油酸的补料分批发酵工艺，并将二者在发酵液中的残留浓度控制在合适范围内，利普斯他汀发酵单位可提高至6g/L以上。中国专利CN103320481B采用了发酵过程添加亚油酸和亮氨酸前体，并结合溶氧控制调控菌株代谢，提高了利普斯他汀的产量，发酵单位可达7～8g/L。中国专利CN103555610A通过对发酵培养基配方配比进行组合优化，利普斯他汀发酵单位提高到约10g/L，但仅停留于摇瓶发酵阶段，未见进一步产业化应用报道。综上所述，目前发酵法生产利普斯他汀仍然面临以下问题：1)补料分批发酵过程涉及亚油酸、亮氨酸等前体，前体供应不足和前体不平衡问题是利普斯他汀高效生物合成的重要瓶颈，此外外源前体底物对菌体有毒害作用，发酵液中的前体残留浓度必须严格控制在适当范围，导致补料发酵工艺过程种的前体流加策略复杂难控；2)发酵过程中亚油酸、亮氨酸前体用量大、价格高，导致发酵原料成本居高不下；3)无补料分批发酵工艺单位产量低，无法进入大规模产业化应用；4)发酵单位有待继续突破和提高。

发明内容

本发明所解决的技术问题是针对现有利普斯他汀发酵方法中发酵单位低、发酵原料成本高、发酵工艺复杂难控、不适用于大规模工业化生产的问题，提供一种发酵单位高、发酵原料成本低、发酵过程控制简单方便、无需添加外源毒性前体的适用于工业化生产的利普斯他汀发酵方法和发酵培养基。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利普斯他汀发酵方法，包括以下步骤：