[发明专利]一种利普斯他汀发酵方法与发酵培养基

权利要求书

1.一种利普斯他汀发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.平皿分离与斜面培养：将利普斯他汀生产菌种孢子在平皿培养基中进行自然分离，培养10～14天；挑取分离较好、孢子丰满的单菌落接种至斜面培养基，培养7～9天，将生长良好的菌种斜面冷藏；

b.菌种斜面摇瓶发酵筛选：将上述菌种斜面接种至摇瓶种子培养基中培养25～35h；以5～10％的接种量接种至摇瓶发酵培养基中培养7～9天，发酵结束后测定效价，挑选出摇瓶效价≥8000μg/ml的菌种斜面继续冷藏，供发酵生产使用；

c.摇瓶种子液制备：将上述摇瓶效价≥8000μg/ml的菌种斜面接种至摇瓶种子培养基中，培养25～35h，得到摇瓶种子液；

d.一级种子罐培养：将上述摇瓶种子液按一级种子罐培养基体积的1～2‰接种至一级种子罐进行培养，罐压0.04～0.05MPa，控制溶解氧(DO)，使DO维持70～80％，培养周期20～30h；

e.二级种子罐培养：将培养好的一级种子罐培养液按二级种子罐培养基体积的8～12％接种至二级种子罐进行培养，罐压0.04～0.05MPa，控制溶解氧(DO)，使DO维持40～60％，培养周期10～20h；

f.发酵罐培养：将培养好的二级种子培养液以8～12％的接种量移种至发酵罐培养基中进行发酵培养，罐压0.04～0.05MPa，通过交替调节搅拌转速75～150r/min与通气量0.8～1.6VVM分阶段偶联控制溶解氧，包括以下步骤：

(1)发酵开始后至DO反弹前：发酵0～24h溶解氧下降时先调转速再调风量，交替进行，风量每次上调0.15～0.2VVM，风量最高1.6VVM，转速每次上调2～4HZ，转速最高150r/min，控制DO≥30％；发酵24～32h：控制DO≥20％，DO低于10％时搅拌转速和空气流量保持最高不变，降温至26.5～27℃；

(2)DO反弹后至发酵结束：发酵至28～36h左右DO迅速回升至70～90％，pH紧跟回升，迅速降低风量和罐压、下调转速，控制DO在40～60％，此过程持续10～20h，控制pH不超过7.30；pH持续上升且高于7.30时，继续通过下调风量、转速和罐压进一步降低溶解氧以控制pH，保证pH下降；DO反弹后10～20h至发酵中后期，pH趋于稳定且呈缓慢下降趋势，通过逐步交替增加风量和转速控制DO在20～30％，最高风量和最高转速不得高于DO反弹前风量和转速的最高值，控制pH在6.8～7.2之间平稳运行；

(3)发酵中后期DO出现掉零后启动补水，DO掉零后开始第一次补水，每隔24h补水一次，补水体积为发酵液体积的4～6％，发酵周期7～9天，发酵单位为10000～13000ug/ml；

上述培养温度均为27～28℃。

2.根据权利要求1所述的一种利普斯他汀发酵方法，其特征在于，所述步骤d中“控制溶解氧(DO)”包括：

通过交替调节搅拌转速200～350rpm与通气量1～2VVM偶联控制溶解氧，使DO维持70～80％。

3.根据权利要求1所述的一种利普斯他汀发酵方法，其特征在于，所述步骤e中“控制溶解氧(DO)”包括：

通过交替调节搅拌转速90～150rpm与通气量0.8～1.6VVM偶联控制溶解氧，使DO维持40～60％。

4.根据权利要求1所述的利普斯他汀发酵方法，其特征在于，所述平皿与斜面培养基包括以下组分：葡萄糖3～5g/L、酵母抽提物3～5g/L、麦芽提取物8～12g/L、碳酸钙1～3g/L、琼脂粉18～20g/L；

所述平皿与斜面培养基灭菌前的pH为6.5～7.0。

5.根据权利要求1所述的利普斯他汀发酵方法，其特征在于，所述摇瓶发酵培养基包括以下组分：甘油15～25g/L、低温豆粕粉35～45g/L、大豆油85～95g/L、粉末大豆磷脂8～10g/L；

所述发酵培养基灭菌前的pH为7.0～7.5。