[发明专利]猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备

权利要求书

1.猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、PRRSV的GP5蛋白和GP6蛋白的抗原表位：获得PRRSV的GP5和GP6蛋白抗原表位数据，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用PRRSV的抗原表位PRRSV-GP5和PRRSV-GP6；

B、Mhp的P46和P65的抗原表位：使用Bepipred Linear Epitope Prediction预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的B细胞表位，使用ProPred-I预测Mhp-P46和Mhp-P65蛋白的T细胞表位，根据表位所在位置和长度进行筛选，筛选出对应使用Mhp的抗原表位Mhp-P46和Mhp-P65；

C、PRRSV和Mhp抗原表位的重组：将PRRSV-GP5、PRRSV-GP6、Mhp-P46和Mhp-P65蛋白抗原表位进行重组，得到重组抗原表位蛋白RP1；B细胞表位之间选择柔性态GGGGS间隔连接，T细胞表位与B细胞表位之间以及T细胞表位与T细胞表位之间选择KK连接；重组抗原表位蛋白RP1的DNA序列进行密码子优化后合成相应DNA片段；

D、对重组抗原表位蛋白RP1进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析；

E、对重组抗原表位蛋白RP1进行二级结构分析：利用SOPM对重组抗原表位蛋白进行二级结构的分析，重组抗原表位蛋白RP1中的各B细胞表位几乎都位于无规则卷曲和β转角；

F、重组抗原表位蛋白RP1原核表达载体的构建：将合成的重组抗原表位DNA片段与原核表达载体pET-28a使用限制性内切酶进行双酶切，之后使用T4 DNA连接酶连接，经验证后，得到重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1；

G、对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证；

H、对重组抗原表位蛋白RP1进行纯化及验证；

I、将重组抗原表位蛋白RP1与弗氏佐剂按照1：(0.1～10)体积混合，混合后重组抗原表位蛋白RP1浓度为0.05～5mg/mL，即为猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗；

所述A步骤中对应使用PRRSV的抗原表位如下：

；

所述B步骤中使用的抗原表位如下：

；

所述重组抗原表位蛋白RP1进行密码子优化后合成相应DNA序列及氨基酸序列，如下所示；

密码子优化后合成的抗原表位DNA序列：

密码子优化后合成的抗原表位氨基酸序列：

2.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述D步骤中对重组抗原表位蛋白进行亲水性、抗原性、柔韧性和表面可及性分析的具体方法为：利用Kyte-Doolittle方法预测重组抗原表位蛋白的亲水性，利用Jameson-wolf方法进行重组抗原表位蛋白的抗原性指数分析，利用Karplas-SChulz方法对该重组抗原表位蛋白进行柔韧性分析，利用Emini方法预测特定区域位于重组抗原表位蛋白的表面可及性。

3.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述PRRSV来自QHD株。

4.根据权利要求1所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述G步骤中对重组抗原表位蛋白RP1进行表达及验证的具体方法为：将重组抗原表位蛋白原核表达载体pET-28a-RP1转化到大肠杆菌BL21中，经诱导表达和破碎后，将分离得到的上清液、沉淀经SDS-PAGE分析，与空白载体对照组相比，重组抗原表位蛋白RP1组上清液存在41.14kDa的蛋白片段；经western-blot验证，重组抗原表位蛋白RP1蛋白进行了部分可溶性表达。

5.根据权利要求4所述猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪肺炎支原体二联多表位疫苗的制备方法，其特征在于：所述G步骤中诱导表达的条件为20℃，20h，诱导剂为0.5mM IPTG。