[发明专利]基于微滴数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针及试剂盒和方法

说明书

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及基于微滴数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针及试剂盒和方法。用于检测猪链球菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。所述试剂盒包括所述引物对和探针；利用本发明的引物对和探针，或试剂盒进行检测，可以实现猪链球菌29个传统血清型(1/2型、1‑19型、21型、23‑25型、27‑31型)的检测，检测结果准确可靠。本发明基于微滴数字PCR技术，建立了猪链球菌微滴数字PCR定量检测方法，特异性好，灵敏度高，稳定性好，能对细菌数进行准确定量检测。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及基于微滴数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针及试剂盒和方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)属球菌科、链球菌属，是一种革兰阳性细菌，有荚膜，无芽孢，多数呈短链或球状排列，需氧或兼性厌氧。猪链球菌在自然界中广泛存在，是一种重要的人畜共患病病原体，能致猪发病和死亡，临床症状主要表现为败血症、脑膜炎和关节炎等；也可感染人，引起脑膜炎、感染性休克，严重时可致人死亡。

根据细菌荚膜抗原的差异，猪链球菌最早被分为35个血清型(1-34型和1/2型)。后来由于32型和34型与其它型差异较大，被划为鼠口腔链球菌。自此，猪链球菌被认为有33个血清型(1-31、33、1/2)。但是，近年来多种细菌分类方法均已证实，血清型20、22、26、33与猪链球菌属于不同的分类，被称为“猪链球菌样菌株”，应当从猪链球菌现有的33个血清型中剔除。猪链球菌病OIE国际参考实验室将在《兽医微生物学》(第6版)和相关国标、行标等中对猪链球菌的血清型进行更正，将“33个血清型”修正为“29个传统血清型”。

快速准确地检测猪链球菌对于感染的早期诊断和治疗非常重要。目前，猪链球菌的检测方法主要有三种类型，微生物学方法、分子生物学检测和免疫学分析。鉴于灵敏性和可靠性的优势，当前鉴定猪链球菌最常应用的是分子生物学检测方法，通常是根据已知的猪链球菌特异性靶基因序列设计引物来鉴定猪链球菌的PCR方法。其中，以猪链球菌看家基因谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，gdh)为靶基因的PCR方法应用最为普遍。然而，近年来猪链球菌PCR检测暴露出如下问题：(1)gdh为靶基因的PCR不能区分猪链球菌和链球菌属某些其它成员；(2)在当前公认的33个血清型中，血清型20、22、26、33被认为是不同于猪链球菌的“猪链球菌样菌株”，但以gdh为靶基因的PCR不能对猪链球菌和“猪链球菌样菌株”进行鉴别区分；(3)普通PCR和荧光定量PCR只能进行定性和相对定量检测，无法做到对细菌数的绝对定量。目前用得最多的细菌计数方法是平板计数法，但该法操作繁琐且耗时长。因此，针对当前猪链球菌PCR检测的现状，急需建立能够特异性检测猪链球菌的绝对定量PCR方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供了基于微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术检测猪链球菌的引物和探针及试剂盒和方法，用于猪链球菌的检测，特异性好、灵敏度高，可以鉴定猪链球菌的29个传统血清型(1/2型、1-19型、21型、23-25型、27-31型)以及对细菌数的绝对定量。

因此，本发明的目的之一在于提供一种组合物。

本发明的另一目的在于提供一种上述组合物在制备猪链球菌的检测试剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种上述试剂盒的使用方法。

本发明的另一目的在于提供一种基于微滴数字PCR技术检测猪链球菌的方法。

本发明所采用的技术方案如下文所述。

一种组合物，包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。