[发明专利]一种基于行为和生化指标的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法及用该方法筛选的药物

权利要求书

1.一种基于行为和生化指标的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴构建斑马鱼幼鱼阿尔兹海默症模型

以3日龄的斑马鱼幼鱼作为模式动物，通过80μM浓度的AlCl₃溶液诱导，建立斑马鱼幼鱼阿尔兹海默症模型；

⑵确定待筛选药物对3日龄斑马鱼幼鱼的最大安全浓度

⑶对斑马鱼幼鱼进行实验处理

将3日龄斑马鱼幼鱼随机分为空白对照组、AlCl₃模型组和药物筛选组，每组鱼的数量相同，并将斑马鱼幼鱼置于6孔细胞培养板中，每孔18～30条鱼，其中空白对照组细胞培养板的每个孔中不添加AlCl₃和任何药物，AlCl₃模型组细胞培养板的每个孔中添加80μM的AlCl₃溶液，药物筛选组细胞培养板的每个孔中添加80μM的AlCl₃溶液和最大安全浓度的待筛选药物，实验处理斑马鱼幼鱼期间每日更换一次水和药液，药物浸泡3天，期间不需喂食；

⑷利用行为学筛选抗阿尔兹海默症药物

在48孔细胞培养板加入相同的纯净水，放入步骤⑶处理3天后的斑马鱼幼鱼，每孔一条鱼，对空白对照组、AlCl₃模型组和药物筛选组处理后的斑马鱼幼鱼进行应激刺激恢复能力测试，测试时，先在测试箱中适应15分钟，然后记录每条鱼60分钟内明暗交替环境下的行为视频，并进行统计分析；

应激刺激恢复能力测试为游动总距离、每分钟游动速度、运动能力和反应能力；

⑸利用生化指标筛选抗阿尔兹海默症药物

对步骤⑶中处理3天后的斑马鱼幼鱼进行收集、处理，检测各项生化指标，并进行统计分析；

所述的生化指标为脑部凋亡细胞数目、Aβ蛋白聚集形成病理性斑块数目和乙酰胆碱酯酶活力；

⑹具有抗阿尔兹海默症药物的判断标准：与模型组相比，药物筛选组的脑部细胞凋亡数量明显减少、斑马鱼幼鱼组织中乙酰胆碱酯酶活力明显升高、Aβ蛋白聚集形成病理性斑块数目明显减少；并且游动总距离变大、对应激刺激的恢复能力得到改善、斑马鱼游动速度恢复且对明暗交替感知明显。

2.根据权利要求1所述的一种基于行为和生化指标的抗阿尔兹海默症药物的筛选方法，其特征在于：步骤⑴构建斑马鱼幼鱼阿尔兹海默症模型，包括以下步骤：

①准备3日龄斑马鱼幼鱼；

②将3日龄斑马鱼幼鱼随机分为空白组和若干AlCl₃处理组，每组鱼的数量相同，将斑马鱼幼鱼均置于24孔细胞培养板中，每孔8～12条鱼，对24孔细胞培养板投放不同浓度梯度的AlCl₃溶液，正常药物浸泡处理3天，每个浓度测试重复3次，对空白组和AlCl₃处理组的斑马鱼幼鱼进行死亡率统计、行为学测试和生化指标测试；

不同浓度梯度的AlCl₃溶液是指10、20、40、60、70、80、100μM的AlCl₃溶液；

③100μM的AlCl₃溶液处理的斑马鱼幼鱼出现死亡现象，舍弃不用，对其余AlCl₃处理组的斑马鱼幼鱼进行行为学测试和生化指标测试；

④行为学测试：48孔细胞培养板加入相同的纯净水，放入正常药物浸泡处理3天后的斑马鱼幼鱼，每孔一条鱼，对空白组、AlCl₃处理组处理后的斑马鱼幼鱼进行应激刺激恢复能力测试，测试时，先在测试箱中适应15分钟，然后记录每条鱼60分钟内明暗交替环境下的行为视频，并进行统计分析；

应激刺激恢复能力测试为游动总距离、每分钟游动速度、运动能力和反应能力；

⑤生化指标测试：对步骤②正常药物浸泡处理3天后的斑马鱼幼鱼进行收集、处理，检测各项生化指标，并进行统计分析；

所述的生化指标为脑部凋亡细胞数目、Aβ蛋白聚集形成病理性斑块数目和乙酰胆碱酯酶活力；

⑥确定模型组AlCl₃溶液的处理浓度：

选择与空白组行为学和生化指标相差最大的80μM的AlCl₃溶液作为模型组中AlCl₃溶液的处理浓度。